液相串联质谱法在生物样品分析中的几个关键问题..ppt

LC/MS/MS在生物样品分析时的关键问题 吉林大学药物代谢研究中心 顾景凯 简介 LC/ESI-MS/MS是近10年来发展成熟的分析技术，它集高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度、高选择性的优点于一体，已成为定量测定生物样品中药物及其代谢产物的最强有力分析手段。 然而，它在分析生物样品过程中也碰到了具有挑战性的问题—基质效应，对于以人参皂苷为代表的中性、热不稳定、难于离子化的皂苷类化合物来说，基质效应的影响更为严重。 离子抑制效应不仅影响检测的灵敏度，也影响定量的准确性，因为这种抑制效应在不同个体的相同生物基质间、甚至同一个生物样品在不同的色谱保留时间可能均不一样，这样就会使测试结果的准确性受到严重影响。 考察基质效应方法 柱后补偿技术（Post-column addition/infusion, PCA/PCI） 补偿标准品溶液，以空白基质提取物进样测定----位置、强度 标准溶液进样； 等量的标准溶液加入空白基质提取物中进样；二者峰面积比较 提高离子化效率 1、改进雾化效果 产生更多更小的液滴，提高离子/分子转化比。 2 、模式选择及优化措施 酸性化合物流动相中加盐,如甲酸铵、乙酸铵，或碱（氨水）来增强化合物的离子化，一般采用负离子检测模式。 碱性化合物流动相中加酸以增强化合物的离子化,加甲酸的效果可能要好于醋酸和三氟乙酸。酸根负离子会与样品正离子结合降低离子化效率，且三氟乙酸会明显的抑制质谱信号响应，一般用正离子方式检测。 3、慎重选择添加剂 商品化的LC-MS级醋酸铵、甲酸铵含有表面活性剂，抑制电离。实验中若需要，可以用氨水加酸调节而成。 4、优化仪器参数（DP、CE、IS等） 5、盐类对离子信号的影响 一般小分子盐的摩尔浓度比较高时，在电喷雾系统中有强烈的竞争性离子化作用，导致较强的离子抑制效应，使得待测物的灵敏度明显降低。 其次，盐类的存在将产生一系列的离子加合峰，使得谱图的解析变复杂。此外，太多的盐类会腐蚀和污染质谱系统硬件，严重时导致硬件损坏，需要及时清洗。 高浓度的盐对电喷雾有明显负作用，微量盐可能有助于某些物质的灵敏度提高。一些不挥发盐，如磷酸盐、氯化钠等，对质谱造成不可逆损伤。高盐类样品，进样前一般要进行脱盐处理。 6、控制进样浓度及上样量 色谱柱、质谱超载 消除/减小基质的途径 样品处理 液相条件选择 质谱条件选择 样品前处理方法 优化液相色谱条件 适当地增加待测组分的保留时间；减少进样体积 优化质谱检测条件 双内标法提高LC/MS/MS分析的准确性 * 吉林大学药物代谢研究中心 吉林大学药物代谢研究中心 基线 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Time, min 20% 40% 60% 80% 100% Intensity, cps 吉林大学药物代谢研究中心 血浆样品经液液萃取处理得到的谱图 Intensity, cps 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Time, min 20% 40% 60% 80% 100% 吉林大学药物代谢研究中心 Intensity, cps 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Time, min 20% 40% 60% 80% 100% 血浆样品经SPE处理得到的谱图 吉林大学药物代谢研究中心 尿样经液液萃取处理得到的谱图 Intensity, cps 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Time, min 20% 40% 60% 80% 100% 吉林大学药物代谢研究中心 Intensity, cps 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Time, min 20% 40% 60% 80% 100% 尿样经2次水洗后的液液萃取处理得到的谱图 吉林大学药物代谢研究中心 吉林大学药物代谢研究中心 液相系统 色谱柱 质谱 三通阀 注射泵 基质效应产生原因 外源杂质的引入（不同厂家生产的试管、肝素锂） 生物样品内源性基质共洗脱作用co-elution 生物样品与分析物形成新的化合物 柱超载作用(column overload) 吉林大学药物代谢研究中心 吉林大学药物代谢研究中心 影响检测的灵敏度 1 影响定量的准确性 2 基质效应的结果 Key Point 2 选择合适的内标 提高待测物的 离子化效率、 降低基质效应