生物工程学中新型的应用合成生物学的体外代谢途径.ppt

生物工程学中新型的应用合成生物学的体外代谢途径 江南 要点 摘要 简介 多酶系统组合 数据的产生 酶系统模型 网络的数学最优化 网络的实际最优化 结论 摘要 大量的酶已经通过自身的进化能够在温和的温度和中性pH的水环境下行使功能。这在原则上使我们有独特的机会在体外构建一个具有相当催化复杂性的多步反应系统。但是，因为这种系统很难去组合,并富有成效的运作，所以它的应用很少能够超出研究的范围。目前在DNA合成、基因组工程学、高通量分析学、基于模型的生化系统的分析和（半-）合理性蛋白质工程学中的进展表明我们已经具有进行这种合理性设计和有效操作这种酶系统所需要的全部工具，并且最终能够获得它们进行初步合成的潜力。 简介 在精细化工催化化学选择性、部位选择性和拮抗选择性等挑战性的反应中，生物转化已经成为了一种必不可少的工具，并且被典型性地用作一系列化学转化中的一种，所不同的步骤就是它们通常通过反应环境（温度、pH和溶剂）的剧烈变化来定性。但是，酶具有独特的优势，因为它们中的大多数已经被选择在水环境中进行操作。这至少在原则上允许我们同时对很多不同的酶进行操作，但也意味着需要处理更大的催化复杂性。当然，这种方法已经广泛应用于通过发酵来生产化学产品或药物，但是在药学中仍有大量另人感兴趣的分子因为不能跨膜、高毒性、比较低的终浓度和或产生，或共合成很多的副产品而很难通过发酵来生产。 通过生物转化而不是发酵生产的、多步化学合成的化合物的主要例子是来自单糖和寡糖组，并且多酶系统在这里已经被应用于很多情况。几种基于糖单元来构建的药物和疫苗已经得到，而且以后还会获得更多。 Figure1.?Complex molecules and pathways as targets for synthetic biology. (a) Arixtra, (b) A premier example of the synthetic power of systems of enzymes (adapted from [9]): the formation of ketose-1-phosphate compounds from sucrose in an eight-enzyme system. 但是，尽管有了很好的基于酶的系统，化学途径在工业中仍然是 占主要位置的。目前酶系统在工业中很少应用的原因： 1.很难比较经济的组合一个酶系统 2.因为底物、中间物和产物与酶的相互作用使得这个系统的动态行为 很复杂，不好理解。此外，系统倾向于朝着细胞稳态，而不是提高生 产力所要求的非自然状态的方向发展 3.在实验中增进第二点的方法非常剧烈 尽管如此，这种多酶系统毕竟在大小和复杂性上被限制了（特别 是对于整个细胞系统），此外，我们收集酶系统的能力一直在加强 ，分析方法的使用范围和潜力也一直在扩大，因此我们至少能够半合 理性的设计酶的功能特性。最终，拥有合理设计所需要的全部条件。  多酶系统的组合 在阐述多酶催化潜力的里程碑性质的论文中，Fessner和Walter组 合了8个酶来将蔗糖转化成几个可能的磷酸酮糖中的一种。 目前已经获得高度工程化株系，但是存在细胞背景干扰 消除干扰的方法： 1.靶基因相对于背景的过量表达 2.从宿主有机体中去除那些产生干扰基因产物的基因 3.期望的酶带上同一个标签序列 有利的进展 1.大DNA片段的非模板驱动—简化人造酶系统的多基因组合 2.宿主的整体最小化基因组库 —减少背景干扰 数据的产生 建立机械模型,它的参数结合起来能够对观察到的特殊现象作出清楚正确的解释,并且这些参数随后能成为系统修饰的靶位点。 方法: 1.依靠纯化蛋白质的复杂研究 缺点：a.这种数据集只在少量的模型系统如糖酵解中完全得到了 b.动态参数通常是在一个人为的条件下被确定的,并且针对复杂的化学情形不能确定参数是怎样变化的 c.没有快速的方法去确定一个系统的酶量,这就使最大反应速率相当难解 2.从相当大的、准确的实验数据集中估计动态参数 （利用质谱定量记录代谢物集） 条件：a.快（亚秒内） b.需要一种有效的，高通量相容的数量分析 Figure 3.?The main steps involved in quantitative MS-based analysis of intracellular metabolites and typical time ranges required for individual steps