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第二章.细胞生物学研究方法 显微成像技术 细胞化学技术(cytochemistry) 细胞培养和细胞融合 分离技术 分子生物学方法 显微成像技术 光学和电子显微镜成像原理 三个基本要素:①照明系统， ②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统 常用的光学显微镜 普通双筒显微镜(binocular microscope) 荧光显微镜(fluorescence microscope) 相差显微镜(phase contrast microscope) 暗视野显微镜(dark field microscope) 倒置显微镜 光学和电子显微镜的基本结构 分辨率(resolution) 　R = 0.61 λ/n Sinα n=聚光镜和物镜之间介质的折射率. 空气为1. 油为1.5; α=样品对物镜角孔径的半角， sinα的最大值为1; λ=照明光源的波长。 0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度 数值孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以使分辨率提高 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 细胞化学技术(cytochemistry) 酶细胞化学技术(enzyme cytochemistry) 通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位 免疫细胞化学技术(immunocytochemistry) 利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。主要分为两大类: 免疫荧光技术和免疫电镜技术。 分离技术 分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离 细胞组分的分级分离 差速离心:低速 高速 密度梯度离心: 离心介质(蔗糖.甘油.氯化铯) 差速离心的原理 密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体 CsCl 密度梯度离心分离DNA 细胞培养(cell culture) 在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。 体外细胞培养的条件 物质营养 生存环境 废物的排除 原代培养(primary culture) 直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养 ■ 细胞系和细胞株(cell line and cell strain) ● 细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系， ● 细胞株: 从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株。 ■ 动物细胞培养方法 ● 贴壁培养 分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分钟至几小时)就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁， 贴壁后的细胞形态形成多态性， 呈单层生长， 所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制(contact inhibition)的特性。 悬浮培养 悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁， 一直悬浮在培养液中生长， 如T细胞的培养就是如此。悬浮培养的条件较为复杂， 难度也大一些， 但是容易同时获得大量的培养细胞 细胞融合与单克隆抗体技术 细胞融合(cell fusion) 指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞(图2-33)。 单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术，因此获得1984年诺贝尔医学奖 细胞融合 单克隆抗体技术 动物细胞核移植克隆技术 1997年，英国苏格兰罗斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通过细胞融合技术利用成年动物彻底分化的体细胞克隆出子代个体，开创了动物体细胞克隆的新时代 分子生物学方法 基因工程技术(gene engineering) PCR技术 选择性基因敲除(gene knockout)与敲进(gene knockin) 乳腺生物反应器技术 基因克隆(gene cloning) 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选 PCR技术 PCR是英文聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction) 的简称，是80年代发展起来的一项具有重大意义的分子生物学技术 转基因敲除小鼠的获得 利用同源重组(基因打靶)使基因失活的方法 基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离、转基因等 两个关键技术:体外重组与转基因鼠 基因敲进(knock in of gene) 将外源有功能的基因(基因组中原先不存在.或已失活的基因),转如细胞与基因组中的同源序列进行同源重组,插入到基因组中,在细胞内获得表达,称为基因敲进. 乳腺生物反应器技术