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葡萄球菌与链球菌的分离鉴定 动科3班 翟鹏 指导老师 任慧英 【摘要】： 掌握葡萄球菌和链球菌的微生物学检查方法，了解两种细菌的形态、排列、生化特性以及主要的鉴别要点。制作普通培养基和血琼脂培养基平板各两个，分别接种细菌划线分离，观察培养基中细菌的生长状况，区分两种细菌。用革兰染色法染色，在油镜下观察两种细菌的形态，通过甘露醇发酵试验、过氧化氢酶试验、凝固酶试验观察细菌的生化特性，得出结论。 关键词：葡萄球菌；链球菌；分离；鉴定 引言： 葡萄球菌（Staphylococcus）广泛存在于自然界、人及动物体表、天然孔道等，多数是不致病的腐生菌。致病菌可引起多种组织器官的化脓性疾病、败血症、食物中毒、毒素休克综合征等。根据色素、生化反应等不同，分为：金黄色葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)。 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，无芽孢，无鞭毛，多数无荚膜，但幼龄培养物可见荚膜。球形或略呈椭圆形，典型的排列呈葡萄串状，在脓汁或液体培养基中常呈双球或短链状。青霉素药物可诱导形成L型。 对生长条件要求不高，在普通培养基上生长良好。需氧或兼性厌氧，最适培养温度为37℃，最适pH为7.4。普通琼脂培养基上形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，直径1-2mm。初灰白色，继而金黄色、白色或柠檬色。在血琼脂培养基上形成完全完全透明的溶血环。 多数菌株能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气。致病菌株能分解甘露醇，液化明胶，血浆凝固酶试验多阳性，触酶试验阳性。 链球菌（Streptococcus）分布广，种类多，包括致病菌、非致病菌和正常菌群。致病菌可致人和动物的化脓性疾病、肺炎、乳房炎、败血症等。 球形或卵圆形，直径0.6-1.0um，呈链状排列或成双。革兰氏阳性菌，无芽孢，多无鞭毛，幼龄培养物可形成荚膜。 大多数兼性厌氧，少数为厌氧菌。普通培养基上生长不良，在加有血液、血清、葡萄糖等的培养基中生长良好。在血液琼脂平板上形成灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径0.5-0.75mm的小菌落。不同菌株溶血不一。在血清肉汤中生长，初期均匀浑浊，后期形成长链，管底呈絮状沉淀，上部培养基透明。能分解葡萄糖、蔗糖，产酸不产气。不产生触酶。 材料与方法 1.1材料 1.1.1待检样品A、B 葡萄球菌、链球菌 1.1.2试剂 生理盐水、草酸铵结晶紫溶液、95%乙醇、革兰氏碘溶液、石炭酸复红、 兔血浆、抗凝剂、酒精棉、碘酒棉、H2O2、甘露醇、香柏油 1.1.3器材 无菌平皿、无菌注射器、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、无菌离心管、离心机等 1.2方法 1.2.1家兔心脏血的采集 采用左仰卧保定法，先用左手抓住耳朵和两条前腿，再用右手抓住两条后腿，让兔子左仰卧在实验台上。先抽取2ml抗凝剂，然后在动物左前肢腋下处依次用碘酒棉和酒精棉消毒，在心脏跳动最明显处下针，直刺心脏，感到针头跳动或有血液向针管内流动时，即可抽血，一次性抽取5mL。 1.2.2血平板的制作 将装在锥形瓶中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右时迅速注射3ml的兔血浆于锥形瓶中，迅速摇匀倾入无菌培养皿中。平板的制作应在酒精灯旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部，左手同时将塞子打开，灼烧瓶口和塞子，用左手大拇指将培养皿盖打开一条缝，至瓶口正好伸入，倾入3mm厚的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌缘，轻轻旋转推进，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后形成血平板。 1.2.3细菌的分离培养 右手取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。待接种环冷却后，取细菌，在平板上划线分离。划完后将培养基倒置于温箱中，培养一定时间后观察结果。 1.2.4细菌抹片的制备 （1）玻片准备 载玻片应清晰透亮，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好 （2）抹片 在载玻片上靠近两个边缘1cm的地方滴上生理盐水，用接种环取单个菌落，在生理盐水中混合，涂抹均匀 （3）干燥 自然干燥 （4）固定 将干燥好的抹片，使涂抹面向上，背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热，进行固定 1.2.5革兰氏染色 （1）初染 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，染色1-2min，水洗 （2）媒染 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3min，水洗 （3）脱色 加95%乙醇于抹片上，脱色0.5-1min，水洗 （4）复染 加沙黄水溶液复染1-2min，水洗 （5）吸干，镜检，观察两种细