试验一 SOD.doc

试验一： 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化 及活力测定 一、原理 超氧化物歧酶(Superoxidedismutase,SOD)是一种能专一地清除超氧离子自由基(02-)的金属酶，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定，其催化反应为：2H++2O2- H2O2+O2 按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250 (Coomassic brilliant blue G-250)在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。 二、实验试剂与器材 [试剂] 1.SOD的提取 ①ACD抗凝剂：柠檬酸10g柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml ②0.9%NaCl：称取NaCl 0.9g，溶于100ml蒸馏水中 ③丙酮 ④95%乙醇 ⑤氯仿 2.SOD活力测定 ①50 mmol/L pH8.3磷酸缓冲液 ②10 mmol/L EDTA钠盐溶液 ③3 mmol/L邻苯三酚溶液(用10mmol /L盐酸配制) 3.考马斯亮蓝G-250法测蛋白质 ①考马斯亮蓝G-250试剂：称取l00mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。 ②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。 [器材] 分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管(1ml，5ml)；离心机；烧杯(50ml)； 三、操作步骤 1.SOD的提取 [1]取新鲜猪血20ml(预先按0.15:1(V/V)的比例加入ACD抗凝剂)，4000r/m，10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCI溶液重复清洗一次，4000r/m，10min，得洗净的红血球浓稠液。 [2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2mL。将上层液用多层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，5min除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2mL。 [3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过液，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按Img/ml溶于蒸馏水，备用。 2.SOD活力测定 [1]邻苯三酚白氧化率的测定 取4.5ml 50mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml 10mmol/L的EDTA-Na,溶液，混匀后25℃水浴保温20min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L HCl作空白，325nm波长下每隔30秒钟测光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。 [2]酶活力测定 操作：与[1]基本一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1mL的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。 [3]酶活性单位的计算 根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性： (A0-Am)/A0x100% 样液稀释倍数 单位活性(U/ml)=————————X反应液总体积数X——————— 50% 样液体积 其中，A0为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后邻苯三