选修生物技术与实践选修生物技术与实践.doc

第一部分??微生物的利用 本部分课标要求：进行微生物的分离和培养。 实验1：大肠杆菌的培养和分离 一、教学要求 基本要求 1．进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2．进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。 发展要求 说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 说明 ? 二、基本内容 1．培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。 培养基的化学成分包括?水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2．无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 灭菌方法： ????????①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。 ????????②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。 ???? ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 ????????④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。 3．实验操作步骤 （1）配制培养基：计算→称量→熔化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板（形成斜面是为增大接种面积）。 ?一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： ?①称量：准确称取各成分。配置LB固体培养基时还需加?1g琼脂。 ?②熔化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 ?③调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 ?④灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，（121℃）1kg/cm2压力灭菌15min。 ?⑤倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 ?（2）接种 ?微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法。 ?平板划线法（方法简单，考试的主要考查点）：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面（也是分离纯化的方法）。在第一次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。 ?划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。 ?划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。 ?取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。 ?稀释涂布平板法（操作复杂，单菌落更易分开）：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。 涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到10－5?～10－7之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。 （3）培养 ?平板倒置放在培养箱中培养是为了使水分蒸发形成的水蒸气凝结成的水滴滴留在盖上，同时防止水滴入培养基并扩散开，已形成的菌落随水扩散，相互影响。 （4）观察结果（菌落数量、特征等）并分析、评价 5．讨论和思考（P24） ?（1）如何操作可以尽量避免被杂菌污染？ ?答：①胆大心细，操作快捷。②注意灭菌操作原则，灭菌