链酶亲和素链酶亲和素.doc

链霉亲和素商品化应用简介 ? 一、链霉亲和素性质 链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。 ??? ?链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为 1015L／mol。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。 ? 二、亲和素和链霉亲和素的比较 相同点 1、?生物素结合能力：AV：13~15U，SA：14~18U 2、?活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸：亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点有色氨酸-懒氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。 ? 不同点： 1、?分子量：AV=66KD, SA=54KD 2、?等电点：AV=10.5, SA=6.0, AV带正电较多，非特异性结合较强。 3、?位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更适合。 4、?生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。 5、?氨基酸序列：AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二硫键。 ? 三、链霉亲和素在ELISA中的应用 酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 生物素－链霉亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式， 1、用于间接包被：可以在固相上先预包被链霉亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过链霉亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗原间接包被。这种包被法主要有以下优点：
?????????????增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。
?????????????阴性对照、空白对照本底低，检测敏感性高。
?????????????用链霉亲和素替代抗体包被微孔，避免了抗体包被微孔时容易发生失活(或不易保存)。
?????????????通过生物素将抗体结合于链霉亲和素包被的酶标板上，可克服传统物理吸附方法造成的抗原抗体结合能力大量丧失的不足。
?????????????生物素标记捕获抗体、酶标指示抗体和样品中的抗原三者在均相中形成复合物后，再通过生物素结合于链霉亲和素包被的酶标板上，由于链霉亲和素和生物素之间亲和力极强，并且具有高度的特异性和稳定性，因而可提高检测灵敏度。 实例：CTnT检测实验中，双抗体夹心ELISA法最低检测值为7.25μg/L，使用链霉亲和素包被法最低检测值达到1.0μg/L，较双抗体夹心ELISA法灵敏度提高7倍。 ? 2、????用于终反应放大：在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。由于SA的等电点低，表面带的正电荷少，因此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱，SA的阴性对照显色明显比AV低，这样在ELISA上应用SA可进一步提高方法的灵敏度。链霉亲和素对生物素化的抗体是一个主动的吸附过程，生物素化的抗体吸附在链霉亲和素表面，抗体排列整齐，分布均匀，抗体容易保持功能，而被动吸附抗体排列极不规则容易导致大量抗体失去功能，所以将生物素-链霉亲和素免疫反应系统引入竞争法中，可以大大提高酶联免疫的灵敏度和特异性。 实例1: 地高辛的生物素-链霉亲和素免疫法测定实验中，传统方法被动吸附只有约5％ 的抗体具有功能 ，生物素-链霉亲和素体系中60％ 的抗体具有功能。 实例2：淋球菌抗原测定方法实验中，生物素-链霉亲和素法检测灵敏度为0.625 μg/L，相当于3.5×104/ml淋球菌，而同时进行常规ELISA测定时，其灵敏度为1.25 μg/L。 ? 四、链霉亲和素相关商品 1、?标记化链霉亲和素 用酶或荧光素等修饰链霉亲和素，应用于ELISA放大检测信号，提高检测灵敏度。 产品实例：
?绿色荧光素（FITC）标记Streptavidin蛋白 产品说明 ?荧光素标记抗体（FA）是目前广泛用于免疫病理、细胞化学、流氏细胞学、病理学及自身抗体的临床免疫中的特异、灵敏、