限制酶的多种切割方法限制酶的多种切割方法.doc

限制酶的多种切割方法 　　 　　一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性末端　　1. 单酶切　　（1） 同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。这是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。　　（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。　　2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamHⅠ与 BstⅠ），其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。　　（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核苷酸组成的黏性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。　　【例1】 （2005年天津理综）：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。　　①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。　　②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。　　③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？　　解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。　　③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。　　（4） 单酶切的优点与缺点。单酶切优点就是操作简单。它的缺点主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。②目的基因与质粒的任意连接：因为目的基因的插入是要有正确的方向才能正确表达，如果载体和目的基因的酶切是使用同一种限制酶，那么目的基因的插入就有两种可能了。一种可能是目的基因的最前端刚好插在启动子邻接下游，这样可以正确表达；另一种刚好相反，目的基因的末端插在启动子的邻接下游（也就是将目的基因翻转180度之后插入进去的），目的基因则没有办法表达。这样就容易形成两种重组DNA分子，其中一种重组DNA分子是我们所需要的，这样就加大了筛选工作量。由此可见，将同一种限制酶切割目的基因与质粒可以获得两种重组质粒，不能使质粒与目的基因发生定向连接。　　2.多酶切　　（1）用两种或两种以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段和运载体。较常见的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的DNA片段和运载体，两者都会产生具有两种不同的黏性末端的DNA片段（两个末端分别用A与B表示），然后混合起来，那么载体分子的A端与目的基因的A端连接，载体分子的B端与目的基因的B端连接，这就形成了重组DNA分子。另外，还可以用不同组限制酶同时去切割含目的基因的DNA片段和运载体，此时要用同尾酶或同裂酶去切割。　　【例2】 （2009年福建理综）：转基因抗病香蕉的培育过程如下图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答：　　构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶，对进行切割。　　解析：题中抗病基因的两侧分别是PstⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，因此只能用这两种酶去切割。目的基因两侧的黏性末端是P和E，为了让目的基因与运载体结合，运载体两侧的黏性末端也只能是P和E，因此也只能用PstⅠ和EcoRⅠ酶去切割质粒。不能单独使用SmaⅠ酶去同时切割目的基因与质粒的原因是SmaⅠ的酶切位点正好在目的基因的中间，如果单独用此酶切割会破坏目的基因的结构。因此，答案是选用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ对含抗病基因的DNA片段与质粒进行切割。　　（2）多酶切的优缺点。多酶切的优点是可以克服单酶切的两大缺点，一是可防止目的基因与质粒的自身环化：多酶切后目的基因与运载体的两侧的黏性末端不相同，因此不能发生自身首尾相连成环状DNA分子。二是可实现目的基因与质粒的定向连接。比如说紧靠启动子下游的是PstⅠ的酶切位点，而EcoRⅠ位点在后面，目的基因的前端是PstⅠ位点，末端是EcoRⅠ位点，酶切之后插进去，就可以保证目的基因的前端刚