植物组织培养 第四植物组织培养 第四章.doc

第四章 植物组培的理论基础 教学目的、要求： 理解愈伤组织、胚状体、细胞全能性、分化与脱分化等概念，掌握影响分化与脱分化的关键因素。 重点：愈伤组织、胚状体、细胞全能性、分化与脱分化等概念。 难点：影响分化与脱分化的关键因素。 1 引言 动物细胞的分化一般是不可逆的。 植物则不同，只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。 １９５８年以来实验已反复证实，无论是体细胞，还是性细胞，离体之后在一定的培养条件下都有可能像受精卵一样发育成一个完整的植株。一个细胞所具有的产生一个完整植株的固有能力称做细胞的“全能性”(totipotency)。 细胞在植物体内即使已进行了最终的分化后仍有可能保持着这种全能性。一个已分化细胞若要表现其全能性首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。 再分化有两种方式，一种是器官发生,一种是胚胎发生。 2 愈伤组织形成的条件 在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋矛它的一定的功能，而不具备施展其全能性的外部条件。 一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。 3 愈伤组织形成的过程 王凯基等（１９８１）以离体培养的油橄榄茎段为材料 ，对其愈伤组织形成过程中各时期的细胞形态和代谢状况的变化做了详细研究，现将他们的结果概述如下： 3.1 诱导期 诱导期是外植体细胞进行分裂准备的时期。在这一时期外植体细胞大小虽然没有多大变化，但细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。诱导期的长短由一系列内外因素决定，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要２２h，但菊芋块经过５个月的贮藏后，诱导期则须延长到４０h以上。 3.2　分裂期 外植体外层细胞开始迅速分裂，不过外植体中间部分的细胞不分裂，形成了一个静止的芯。在这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态。 当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期。外植体细胞由原来的静止状态经过诱导期的分裂准备之后进入分裂高峰，回复为分生状态，这整个过程即为脱分化 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织。愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留存原来培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化。 3.3形成期 形成期是指外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。 进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，包围着内部已分化的管胞形成。 4 愈伤组织增殖的方式 为了研究愈伤组织在培养期间的形态变化，Caplin（１９７４）把已建成的烟草愈伤组织切成的小方块，置于琼脂培养基上培养。结果发现，愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。由于小方块组织迅速增殖，加之在其表面或近表面瘤状物的生长，数周之后小方块变成了一个表面不规则的菜花状组织。 5愈伤组织状态的调控 优良的愈伤组织通常必须具备以下４个特性中的２～３个特性： 1、高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。 2、容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。 3、旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 4、经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。 为了达到以上目的，诱导愈伤组织时通常采取的策略是： （1）选择适当的基因型和适当的外植体； （2）选择正确的培养基； （3）采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。 6 细胞分化 植物细胞分化是植物发育过程中的一个十分重要的基本事件。无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化的研究重点是维管组织的分化，特别是木质部成分的分化。 6.1影响维管组织分化过程的因子 生长素和蔗糖是对维管组织分化过程有显著影响的两种物质。它们能从质和量两个方面影响维管组织的分