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何为层流技术及其在FCM中的应用 管道中液体稳定流动时是以管道的轴线为中心分层流动的，管道中层流的形 dρv 成要满足雷诺数Re= —— 2300。层流是液体稳定流动的必要条件，为细胞分析提供技术 Η 保证。 根据这一原理，FCM中的细胞在稳定流动的液流中始终趋向沿管轴方向运动，一旦偏离了管轴，它就立刻会收到指向管轴方向的力的作用，重新回到沿管轴的方向继续流动。同样的原理，非球形细胞流动时其细胞长轴总是与管轴方向一致。 2.流式细胞分析术：以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 3.多参数分析 4. 前向角散射信号（FSC）：信号强弱与细胞的大小和活力有关。对于一些非球形细胞（某些红细胞、精子）由于在液流中的不同取向，所获得的FSC信号差别很大。 侧向角散射光信号（SCC）：信号强弱与细胞内颗粒多少相关。细胞凋亡时其SCC常变大，同时FSC常减小。 5. FCM的荧光补偿（fluorescence compensation）：利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术。 6. FCM的数据储存方式:List Mode方式,用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。 FCM的不同显示方式 1.）单参数直方图（Histogram） 2.）双参数数据显示：二维点图(Dot Plot)：每个点代表一个细胞 等高线图(Contour Plot)：在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同 二维密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)：Z轴为细胞数 3.）三维图(3D Plot)：三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。 7. 酶消化法应注意哪些条件? 1.）配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的适宜条件与活细胞要求的生理环境，其中包括渗透压，pH值(缓冲液)，各种离子浓度，酶激动剂等。 2.）酶溶液的适用浓度：胃蛋白酶 0.5%；胶原酶 0.1%；胰蛋白酶0.25%( 含1-10μg/ml DNase ) 3.）酶消化过程的最佳温度与持续时间：37℃,15-20分钟，不同组织不同酶而异；二次消化；反复数次,直至组织块完全消失。每克组织10-15ml。 4.）终止酶消化反应的方法和措施：加酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂等）；降低酶反应温度，将细胞悬液管移至冰水浴中；对于蛋白酶，加入少量血清以减弱酶对细胞的不利影响；通过反复离心漂洗，移去酶消化液，彻底终止酶消化过程等。 8. 常用的单分散细胞的方法有哪些?及其各自特点（补） 酶消化法；机械法；化学试剂处理法 9. 荧光细胞化学过程的特异性：FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即荧光染料与细胞成分是否为特异性结合。严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。 荧光细胞化学的化学定量关系：在相同的条件下，荧光反应产物（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系。 足够的特异性和可靠的定量关系是对每一荧光细胞化学过程的两个基本评价标准。 收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。 纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。 10.细胞样品制备技术的优缺点及注意事项 1.）机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量； 2.）可用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰； 3.）酶学法，化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。 11.DNA含量分布线性直方图的分析 1.）利用PI对细胞核DNA进行了荧光染色； 2.）X轴代表了细胞DNA相对含量，Y轴代表了细胞数； 3.）第一个峰由G0/G1细胞组成，即正常二倍体细胞，大多数细胞处于这一期；第二个峰由G2/M细胞组成，即四倍体细胞 4.）G0/G1峰左边的低道上可出现亚G1峰，是凋亡细胞、细胞碎片、杂质等造成的；G2/M峰右边的高道上也可出现一矮峰，是由多倍体及细胞团块等引起的。12.细胞凋亡散点图的分析 1.）PI标记DNA，Annexin V 标记PS； 2.）X轴为Annexin V-FITC，Y轴表示PI； 3.）LL：正常细胞，PI(-) , Annexin V(-) LR:早期凋亡细胞，Annexin V（+），PI（-） UR：晚期凋亡细胞，Annexin V（+），PI（+）