细胞试验 2细胞试 2.doc

细胞培养用试剂的配制 1、胰蛋白酶（trypsin）： 0.02 g EDTA-2Na、0.25 g胰蛋白酶，用PBS定容于100 mL容量瓶中。 2、PBS： NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 2.9 g、KH2PO4 0.2 g，用超纯水定容于1000 mL容量瓶中。 3、MTT（5 mg/mL）：噻唑蓝，一般现配现用，过滤后4℃避光保存，MTT变为灰绿色时不可以再用。MTT不好溶解时，可以多吹打几次，或者磁力搅拌器30min，外包锡箔纸。 MTT 500 mg，用PBS定容于100 mL容量瓶中。 4、双抗： 氨苄西林（U）0.5 g、硫酸链霉素（80万单位）1.25 g，用超纯水定容于100 mL容量瓶中。 注：* 有时不需要准确定容； ** 细胞用试剂需用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌； *** 链霉素终浓度为100 μg/mL，氨苄西林终浓度为50 μg/mL。（0.5÷100＝0.005 g/mL，溶于100 mL培养基，0.005 g÷100 mL＝0.05 mg/mL，即50 μg/mL） **** 为了充分溶解，4℃过夜，然后再分装于1.5 mL EP管中，-20℃保存。 细胞初代培养 准备：培养用品消毒放入经紫外照射30min的净化台内。组织块，培养液易受紫外损伤的物品在培养时再放入操作野中。 漂洗、剪切、消化组织：PBS洗组织块3次，组织块剪成3-5mm2块状，剪碎的组织放入三角烧瓶中，加入比组织量多30-50倍的0.25%的胰蛋白酶消化液，置于磁力搅拌器上（常用消化温度37℃，pH7.6-8.0），组织蓬松呈絮状可终止。也可以采用冷消化法，即加入胰酶4℃过夜或更长。消化时间依据组织块大小和硬度而定。 分离：消化过程中消化液变浑浊，可吸取少量在镜下观察，若组织分散成细胞团或者单个细胞，立即终止，低速离心（500-1000 rpm/ min）5min,去上清，Hanks液漂洗3次，离心去上清，共两次，用筛网滤去为充分消化的组织块，低速离心（500-1000 rpm/ min）5min,去上清，加入一定量的培养液。 细胞传代培养 每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5-10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10-20代以上，确定为传代细胞。 初代培养的首次传代是关键： 贴壁细胞生长密度不高时或未覆盖整个瓶底时不可急于传代。 首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞生存和繁殖，若消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。 细胞的分类：1、贴壁细胞（NH3T3细胞、293细胞即人胚肾细胞、原代培养的小鼠胚胎成纤维细胞均为贴壁生长细胞）——此类细胞贴壁较牢，采用 酶消化法进行传代 2、半贴壁半悬浮细胞——此类细胞贴壁不牢，传代时可直接进行吹打 3、悬浮细胞——离心、去上清、重新接种 1、弃去培养基，PBS冲洗3遍 2、加1 mL胰酶（2.5 mg/mL）消化； 3、弃胰酶，加新鲜培养基3～5 mL、血清少许终止消化，吹打掉瓶壁上的细胞，充分吹打； 4、将细胞悬液转至1.5 mL离心管（1 mL每管）中，1000 rpm离心5 min，吸去上清； 5、弃去EP管（或离心管）内的培养基，每管加入1 mL新鲜的完全培养基，反复吹打，将沉淀重悬，即使细胞充分分开； 6、将细胞悬液转移至含有1%双抗、10%血清的培养基内（共6 mL），吹打均匀； 7、观察细胞是否具有团块，放入5% CO2培养箱中培养。 注：*PBS使用前要预热，否则易使细胞未经消化就大片脱壁。 *加入的消化液的体积以液面刚刚盖住细胞为宜。 *在倒置显微镜下观察细胞，若细胞变圆、间隙增大，相互之间不再连接成片，并且边缘变亮，或者细胞有成片浮起的现象，表明此时细胞消化适度，要立即终止消化。 *吹打时按顺序进行（消化后吹打细胞，用移液器吸取液体时沿培养皿从左到右、从上到下依次轻轻吹打培养皿底壁），确保所有瓶壁 均被吹打到，防止细胞丢失，同时尽可能不要出现泡沫，以免导致细胞机械损伤，制成细胞悬液。 * 弃去培养基时，培养瓶中的培养基直接倒掉；培养板中的培养基用一次性注射器抽去。 *细胞的换液：2-3d后吸掉1/3体积的培养基（培养基要提前预热到37℃），补加入1/3体积的新鲜完全培养基，观察细胞生长状况。 ┗ 细胞传代培养时，细胞离心后的时间尽可能的短，防止细胞重新悬浮。可以在离心后先吸去旧的培养基，添加上新的培养基。 ┗ 24孔培养板，每孔加细胞悬液500 μL。 ┗ 6孔培养板使用前应先用培养基润洗，以减少培养板表面张力。 ┗ 一次性过滤器每过滤一次液体，会损失液体大约300 μL。配制时要比预先算好的溶液体积再多配3