血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)分解.ppt

血凝（HA）和血凝抑制试验（HI） 主要内容 一、基本概念 二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用 三、基本操作 四、注意事项 一、基本概念 1、血凝试验(HA) 1.1 定义 某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA) 。 常见于正粘病毒（如AIV）、副粘病毒（如NDV）和某些黄病毒（如JEV）、痘病毒、以及经过处理过后的IBV。 1.2 血凝类型： (1) 可逆转型　 血凝素与病毒颗粒易分开，经超速离心后，病毒颗粒沉淀于管底，血凝素则游离于上清液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆的，即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的血凝素后，可再与该血凝素发生凝集。 如天花、鼠疫等病毒。 (2) 不可逆转型　 血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，不经过特殊处理血凝素不能与病毒颗粒分开，这种病毒引起的红细胞凝集，是不可逆转的。在一定的温度 (37℃)下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键的N-乙酰神经氨酸酶，当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集病毒的能力。 如流感病毒、鸡新城疫病毒等。? (3) 凝集条件严格型　 有些病毒及其血凝素凝集红细胞的条件很严格，不仅对不同种动物的红细胞有严格的选择，即是对同种动物，由于性别和年龄的不同，对红细胞的凝集性能亦有差异（如JEV对公鹅的红细胞凝集性能比对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好） 。除此之处，还对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求均很严格。 1.3 原理 血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如: 痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。 流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。 2、血凝抑制试验(HI) 2.1定义 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。 2.2原理 特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。 二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用 1、用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 三、实验步骤（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范） 1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。 四、注意事项 目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果。 1、注意抗原相的差异 实践中，经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，这是由于禽流感病毒变异较快，存在抗原相的差异。 禽流感病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为“R”相；对本株效价高对异株低的为“P”相；对本株及异株均低的为“Q”相。 如果在试验中出现相的差异，所测结果会相差2-3个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度 。 2、注意消除非特异性因素 禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制试验时会出现2-3孔有凝集现象。 因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。 常用消除方法（FAO推荐） 1、鸡的红细胞吸附法 1.1试剂 鸡的红细胞：要充分洗涤； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 1.2方法 加入25μL鸡的红细胞到100μL血清中； 4