AD自噬改动标红.doc

二苯乙烯苷通过抑制的Beclin-1、LC3-Ⅱ表达改善 APP695V717I转基因鼠的行为学障碍 罗红波,石向群, 郭建魁,张志强,汪泳,李芸,尹榕 （兰州军区兰州总医院神经内科,甘肃省 兰州市 730050） 【摘要】　目的 探讨在APP695V717I转基因鼠模型中，二苯乙烯苷(TSG)对大鼠行为学的保护作用及其对自噬分子Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达影响。 方法 选取10月龄APP695V717I转基因小鼠40只，随机数字表法分为药物组组、模型组，各20只, 药物组给予TSG灌胃 1个月, 同背景同月龄C57BL/6J小鼠为正常对照组。行为学检测应用Morris水迷宫实验和Y电迷宫实验。反转录聚合酶链反应及免疫印迹法检测海马神经元自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的mRNA及蛋白表达变化。结果 在模型组中，大鼠Y电迷宫躲避所需的电刺激次数增加，Morris 水迷宫测试中潜伏期延长, 游泳路程增加及穿越平台次数减少；Beclin-1和LC3-Ⅱ的mRNA及蛋白的表达增高，与对照组比较有统计学意义(P0.05)；TSG药物干预后，大鼠躲避所需的电刺激次数减少，潜伏期缩短, 游泳路程缩短，穿越平台次数增加；Beclin-1和LC3-Ⅱ的mRNA及蛋白的表达较模型组下降(P0.05)，差异有统计学意义。结论 二苯乙烯苷可通过下调自嗜通路中Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达，以抵抗Aβ的神经毒性作用对内质网功能的损害，从而改善大鼠的学习记忆、空间定向等行为学表现。 【关键词】　A PP转基因小鼠；自噬；二苯乙烯苷；行为学 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种神经系统变性疾病，其主要的病理学特征之一是脑组织中出现大量老年斑[1]。老年斑主要由β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)形成，Aβ是通过淀粉样样前体蛋白（APP）的异常剪切、折叠后所形成，在细胞内，对这种异常折叠的蛋白质，细胞可通过泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)和自噬溶酶体途径来调控蛋白、细胞器的降解，从而保证蛋白质的正常工作，维持细胞功能的正常运行。有学者早期研究发现AD患者在病理上表现为大量囊泡的堆积，但这种表现的机制及其在AD发病机制中的作用却没有得到明确的阐述；2006年，有学者建立自噬途径的重要蛋白Apg5/Apg7基因敲除的大鼠模型，发现该模型表现出神经变性疾病的一些表型，使得自噬途径在神经变性疾病得到了关注和重视[2-3]。本实验采用APP695V717I转基因AD动物模型观察大鼠海马神经元自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达情况并探讨其意义。 AD患者的学习记忆及工作能力的逐渐丧失给家庭及社会带来沉重的负担，但目前其治疗尚无十分有效方法与药物 。研究显示何首乌的主要有效成分之一（2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(2，3，5，4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside，二苯乙烯苷，TSG)能减少β-淀粉样肽诱导的老年斑沉积，改善痴呆模型大鼠学习记忆能力，降低淀粉样前体蛋白(APP)的表达水平 。我们通过观察APP695V717I转基因鼠的行为学表现及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ在海马的表达情况并探讨其意义，进一步揭示AD新的发病机制，以及何首乌提取物二苯乙烯苷治疗AD的主要作用机制及药物靶点。 材料和方法 一、材料 1.实验动物分组及干预：10月龄APP695V717I转基因小鼠40只，雌雄各半(许可证号01-3001)，及20只年龄匹配的同背景C57BL/6J小鼠，雌雄各半(作为正常对照)，均购自中国医学科学院实验动物研究中心。转基因小鼠随机数字表法分为TSG组、模型组，各20只。药物组给予TSG灌胃 1个月，每天1次，灌胃量按5 ml/kg计算。正常对照组给予生理盐水灌胃。 2.主要试剂和药物：Beclin-1和LC3-Ⅱ一抗购于Stressgen公司；引物自行设计，由上海华大基因有限公司合成；Trizol、Taq酶、逆转录酶购自MBI公司。二苯乙烯苷为从何首乌中提取分离的干粉，含量为68%（湖南中医药研究所提供)，实验时用水溶解为100 mg/kg的浓缩液。 二、方法 删掉“大鼠模型的建立、取材及干预” 1.行为学检测：(1)Y电迷宫电击实验：电击次数表示其学习记忆的获得能力，记录每只大鼠学会逃避电刺激次数，以30次为最大值计数。（2）Morris水迷宫定位航行实验(PNT )：每天08 :00-11:00之间对每只大鼠进行训练, 不选平台所在象限作为入水点, 按顺时针方向把大鼠面向池壁放入水中, 检测大鼠隐匿平台潜伏期。如果在规定的最长时间120