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专题1基因工程复习知识点和练习.
选修3现代生物科技专题
专题1基因工程知识点背诵
1.1 DNA重组技术的基本工具
一、概念:基因工程又叫做DNA重组技术,就是按照人类的要求,把一种生物的个别基因复制出来,加以修饰改造,然后导入另一种生物的细胞里,定向地改造生物的遗传性状。
二、基因操作的工具:基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工,即对DNA分子进行剪切和拼接,其主要工具有:
1.分子手术刀:限制性内切酶,简称限制酶。这种酶主要存在于原核生物中,由于每种限制酶能识别特定的核苷酸序列,因此,限制酶能在特定的切点上切割DNA分子。
特点:A、专一性:每一种限制酶只能识别双链DNA分子一种特定的核苷酸序列。
B、切点:各种酶切点不同,即具有特定的酶切位点。
作用:在特定的切点上切割DNA分子形成两个完全相同的黏性末端。
种类:有4000多种限制酶,切割成的DNA末端可分为两大类:黏性末端和平末端(中轴线切口为AT,CG)
2.分子缝合针:其实质是一种DNA连接酶。
作用:是把两个黏性末端之间的缝隙“缝合”起来。(实质是“缝合”磷酸二酯键 )
酶的分类:
A、E.coli DNA连接酶(从大肠杆菌中分离得到,只能对互补链的黏性末端起作用)
B、T4 DNA连接酶 (对两种末端都起作用)
DNA连接酶与DNA聚合酶的异同:
(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来因此DNA连接酶不需要模板。
二者虽然都是由蛋白质构成的酶,但组成和性质各不相同。
(1)从基因文库中获取目的基因
A、基因文库概念:将含有某种生物不同基因的多个DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称基因文库。
概念理解(实质是:一细菌群体中含有这种生物的不同基因)
B、基因文库分类:
基因组文库:含有一种生物全部基因(理解:相当国家图书馆)
cDNA文库(部分基因文库):只含有一种生物部分基因(理解:某市图书馆 )
(2)利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术是聚合酶链式反应的缩写,是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术。实施PCR技术的条件:①一段已知的目的基因的核苷酸序列②引物③热稳定DNA聚合酶④原料(脱氧核淦酸核苷酸)⑤能量(ATP)。
实施PCR技术的过程可以在PCR扩增仪中自动完成。
二、基因表达载体的构建(目的基因与运载体结合),是基因工程的核心步骤
基因表达载体的组成:表达载体=启动子+目的基因+终止子+标记基因
表达载体的功能: 使目的基因在受体细胞中存在,并且遗传给下一代,使目的基因表达和发挥作用
启动子:是特殊的DNA片段位于基因的首端,它是RNA聚合酶的识别和结合部位,用于启动转录产生mRNA。
终止子(相当红色信号灯):位于基因的末端用于终止转录过程。
标记基因:鉴别受体细胞是否已含有目的基因。
基因表达载体的构建的步骤:
用同一种限制酶去切割质粒和目的基因,露出 ,加入DNA连接酶,形成重组DNA分子。
三、将含目的基因的表达载体(重组DNA分子)导入受体细胞
1、将含目的基因的导入植物体细胞
(1)农杆菌转化法
转化的概念:目的基因进入受体细胞内,在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
农杆菌转化法的原理:
农杆菌易感染双子叶和裸子植物,农杆菌 的Ti质粒的上的T—DNA可转至受体细胞,并整合到受体细胞的染色体上。
理解:目的基因搭“顺风车”是借细菌或病毒侵染细胞的过程来进行(P12图1-11)。
(2)其它方法:基因枪法、花粉管通道法。
2、将含目的基因的表达载体导入动物体细胞方法:显微注射技术。基本步骤:P13
3、将含目的基因表达载体导入微生物体细胞,如,导入大肠杆菌细胞的基本步骤:
Ca2+处理→细菌细胞壁通透性增加→感受态细胞
重组表达载体DNA溶于缓冲液中与感受态细胞混合→吸收DNA
四、目的基因的检测和鉴定(是检测目的基因是否成功导入的关健步骤)
(1)检测的意义:鉴别目的基因是否真正导入受体细胞。
(2)检测方法: DNA分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术
核酸分子杂交(即DNA探针法)是根据碱基互补配对原则,把互补的双链DNA解开,把单链的DNA小片段用放射性同位素、荧光分子等进行标记(即基因探针),之后同被检测的基因组DNA(或mRNA)杂交,如果显示杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA(或表明目的基因已转录出了mRNA)
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