药物筛选方法.doc

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药物筛选方法

药物筛选的方法 分子水平筛选 Microbead FCM联合筛选FCM(流式细胞术(flow cytometry是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合,利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM,不同荧光标记的Microbead就被分离出来,于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。 原理:它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。 应用:免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩,为SDS(聚丙烯酰胺凝胶电泳闪烁接近检测于 1995 年在美国和日本被提请专利。由于当固定在固相载体或 96 孔圆片上的受体被放射性标记的材料筛选时,需要过滤等额外步骤以定量分析放射性。为简化此步骤,研究人员发明了闪烁接近检测(SPA,Scintillation Proximity Assay)法。在这个方法中,高产量的荧光分子被附到带有受体的固体上,通过放射性配体引起成键反应。同时,仍存留于溶液中的未成键的放射性配体被水分子抑制,而与荧光受体成键的配体的放射线被其周围的荧光分子吸收。因此,活性分子仅以荧光量分析而没有任何额外步骤就被简单的筛选出来 该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时,放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离,现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合,将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上,从而产生光子,减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程,使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行,适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记,而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收,以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。 SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。 荧光材料在一定条件下每个分子能释放数千个光子,使理论上的单一分子水平检测成为可能。这种特性以及可采用多种荧光模式,使得荧光检测技术Fluorescence Assay) 成为高通量筛选必不可少的方法 。然而,这个方法也有局限。荧光化合物不能像放射性同位素那样取代活性抗原的元素,它们必须连在抗原的某些连接位点上,而且这种修饰不能影响抗原的活性。荧光技术在非细胞相筛选分析中广为应用。 荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)是一种用来确定与不同荧光团结合的二个分子间距离的技术。当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时, 其能量就能有效地通过偶极子相互作用转移给受体。能量转移效率随供体和受体之间距离成相反变化,故分子间小的空间变化(几个埃)能显著影响能量的有效转移率。R0(50%能量转移效率时D 的距离)与供体的发射域和受体的吸收域的重叠同时受体的量子产量还与溶剂有关。如果两个荧光分子相互距离小于R0,当供体的吸收光被发射的时候,理论上受体的荧光将会增强。如果其距离大于R0,当同样的光被发射时,将会检测到供体的荧光增强。所以,如果将荧光分子连接到如蛋白酶那样可作激酶的小分子酶上,很容易检测酶的活性。Rodems等用FRET实验平台高通量的筛选了酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶的作用底物荧光分析的灵敏度常受来源于试剂和容器等背景信号的限制为了降低荧光背景,人们发明了与时间相关的荧光技术(TRF,Time resolved Fluorescence)。普通荧光分子的激发态存在周期通常仅有几微秒, 但是镧系元素的可达几毫秒。利用脉冲激发光源和门控检测器(或相调节技术)可在样品荧光信号采集之前让背景荧光信号消失。可与 FRET联用, Kennedy等利用TRFFRET技术测定了与早老性痴呆症密切相关的蛋白活性。 荧光偏振检测(FPA,Fluorescence Polarized Assay)可测定一个由平面偏振光线激发的分子所发射出水平和垂直平面的光线,

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