抗体药物制备技术研究进展.doc

1 绪论 以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程药物近年来取得了突破性进展，并成功应用于临床。一方面，随着功能基因组学与蛋白质组学的研究进展，将发现与确定越来越多新的与疾病相关的分子靶点，而与这一发展相适应的、具有高度特异性、针对疾病相关分子靶点的抗体药物将被陆续研制成功；另一方面，抗体药物用于癌症、心脑血管疾病、病毒感染以及类风湿性关节炎等疾病的治疗，受到了广泛关注。 抗体药物发展的历史 200多年前，人们将白喉杆菌培养物上清液中分离到的可溶性毒素注入马体，发现得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。1891年，法国人Babes等用采自经狂犬病疫苗免疫的人或犬的全血治疗被疯狼严重咬伤的患者，这是抗狂犬病最早应用的例子[1]。1975年Kohler及Milstein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术。该技术使人们通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体（monoclonal anti-body，Mab），这是产生抗体的重大技术革命。1984年诞生了第一个基因工程抗体—人—鼠嵌合抗体。然而真正以基因工程操作的方式制备抗体却始于1989年底，英国剑桥的W inter小组与Scrips研究所的Lerner小组的创造性工作，他们利用PCR技术克隆人的全部抗体基因，并重组于原核表达载体中，用标记抗原就可筛选到相应抗体，当时称为组合抗体库技术。20世纪90年代后，这一技术不断发展，陆续出现人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体、三链抗体、微型抗体等）、融合蛋白抗体（免疫抗体、免疫黏连素等）及特殊类型抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体等）[2]。近年来，发展的噬菌体抗体库技术及核糖体展示抗体库技术,更易于筛选高亲和力抗体和利用在体外进行的方法对抗体性状进行改造[3]。 抗体药物的结构与功能特点 抗体分子的结构 早在20世纪50年代末期，把电镜的观察结果结合Poler利Nisonoff的研究结果，导致了经典的免疫球蛋白单体的Y型结构模式[4]。现已得知，抗体分子单体的基本结构是由4条肽链组成的四聚体，包括2条完全相同的重链（heavy chain，H链）及2条重链间以二硫键相连，形成“Y”字形结构。重链由约450个氨基酸（IgG、IgA、IgD）或570个氨基酸（IgM、IgE）组成，轻链由约214个氨基酸组成。完整抗体的分子质量约为150kDa[5]。根据功能，又可把重轻和轻链分为可变区和恒定区，可变区中的互补决定区与抗体结合抗原的多样性有关；而恒定区的结构与抗体的生物学 活性有关[6]。 抗体分子的功能特点 抗体最基本的生物活性就是特异性识别抗原决定簇。分泌性抗体能激活补体的经典途径和旁路途径，穿过上皮细胞层在黏膜表面对病原体形成一层屏障，通过粒细胞和巨噬细胞的调理诱导吞噬细胞，促进NK细胞和淋巴细胞引起的抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应，促进嗜酸粒细胞引起的脱颗粒过程。膜表面免疫球蛋白还具有诱导激活、诱导无反应性、诱导分化、诱导B淋巴细胞凋亡的作用。记忆B细胞的膜表面免疫球蛋白具有识别、降解和将特异性抗原提呈给T细胞高亲和力受体的能力。 可变区是抗原结合部位，提供免疫应答的特异性。超抗原与抗体的结合是典型的抗原抗体结合区域以外的相互作用。普通抗原只激活T细胞总数的0.01%，而典型的T细胞超抗原可同时激活T细胞总数的5%至25%[7]。重链可变区和轻链可变区也参与了超抗原与抗体的结合。 恒定区的功能包括①激活补体。②提供效应细胞的结合位点。③作为分类的依据并提供转运位点，不同类或亚类的抗体在生物体中具有不同的稳定性[8]。 抗体药物的分类 抗体药物从组成上来讲应分为2类，一类是抗体本身即是药物；而另一类是由抗体本身与治疗药物（如放射性核素,毒素等）结合构成。 抗体药物的制备 基因工程抗体药物的制备主要归因于PCR技术的使用（可以通过一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因），以及大肠杆菌表达体系的建立（能成功获得具有抗原结合功能的抗体分子片段）。目前主要应用抗体库技术制备单链抗体，所谓抗体库（antibody library）技术，就是用基因工程技术克隆出全套抗体轻链和重链可变区基因，再重组到特定的原核表达载体，转化入大肠杆菌中表达有功能的抗体分子片段，并通过亲和筛选获得高特异性的抗体可变区基因的技术。利用抗体库技术筛选获得抗体基因，最终可用于构建和制备基因工程抗体药物。 常见的抗体库技术有：①采用RT-PCR技术和λ噬菌体表达载体进行抗体可变区基因筛选的噬菌体展示技术（phage display）[9]。 抗体药物制备技术研究现状 4．1 抗体药物在各研究领域的发展情况 人源化抗体 人源化抗体的制备技术有一个漫长的发展过程，总结和梳理其技术的历史