实验二 动物细胞融合.doc

实验二 动物细胞融合 【实验目的】 了解动物细胞融合的常用方法。 学习化学融合和电融合的基本操作过程。 观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒细胞诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。 病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞的融合。用紫外线灭火后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。这种诱导细胞融合的方法缺点是目标细胞不明确，融合后的细胞需要再次筛选出目标融合细胞。 化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和力与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性，PEG是被广泛使用的化学融合剂 电激诱导融合包括电诱导，激光诱导。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破 细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。【实验用品】 材料鸡血红细胞 试剂50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 器材显微镜、离心机、恒温水浴锅、盖玻片、载玻片、离心管、滴管、废液缸等【实验步骤】 取鸡血2ml加入2ml Alsever溶液，再加入6ml Alsever溶液，混匀后制悬液。 取步骤1中混匀的悬液1ml，加入4ml 0.85%的氯化钠溶液，放入离心管，1200r/min离心5分钟。 将上一步的沉降血球去上清液后（约剩余0.1-0.2ml），加入GKN溶液至1-2ml,使之稀释成10%的细胞悬液。 取上述10%的血球悬液1ml，加入3mlGKN溶液，使每毫升含血，即1.5×107个/ml。 (1)取步骤4中的液体1ml加入0.5ml 50%的PEG溶液，混匀滴片，在常温下静置2-3分钟后，镜下观察。（2）取步骤4中的液体1ml加入0.4ml 60%的PEG溶液，按照步骤（1）的方法制片观察。 【实验结果】细胞融合分为两个细胞刚接触，细胞开始融合，细胞形成哑铃状，两细胞融合成椭球状，两细胞融合成球状合并为双核细胞，这几个阶段。经过镜检只观察到了前三个阶段。图1为两细胞刚接触，图2为两细胞开始融合，图3为细胞形成哑铃状。 A B 图1. 两细胞刚接触（10×40 A为PEG浓度50% B为PEG浓度60%） A B 图2. 细胞开始融合（10×40 A为PEG浓度50% B为PEG浓度60%） 图3. 细胞形成哑铃状（10×40 PEG浓度为60%） 【分析与讨论】滴加PEG溶液时应注意要沿着管壁换换滴加，PEG溶液密度比较大，会沉入底部。而静置一段时间是为了增大高浓度PEG溶液与细胞的接触时间，从而增加细胞融合的概率。经过镜检，可明显观察到相比于浓度50%的PEG溶液，浓度60%的PEG溶液的融合效率明显高很多。镜检下只看到前三个阶段融合的细胞可能是由于静置的时间不够长，融合时间不够，并且在加入GKN溶液时有些过量，导致细胞浓度降低而造成的。 【拓展】 细胞融合的理论和实际意义 细胞融合的理论化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。 过程 细胞膜有内外两层，细胞融合首先发生在外层，然后再到内层，由此就出现了两种融合通道，细胞体内物质通过这两种通道转移。病毒膜与目标细胞融合时，只出现一种融合通道，即导致融合的基因只能在病毒中找到，而在目标细胞中却找不到。但是，通过EFF-1发生的细胞融合则是一个双向融合过程，需要EFF-1出现在两个相互融合的细胞中。 赞同 细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交 架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段。它在于从此打破了仅仅依赖有性杂交 重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩 大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋 白动力学