小鼠脾细胞原代培养及染色法鉴定细胞死活.doc

姓名 刘睿 实验题目小鼠脾细胞原代培养及染色法鉴定细胞死活 科目 细胞生物学实验系年级 2012级生科2班 学号201200140063同组者 马俊才日期 2012.04.02 【实验目的】 回顾细胞培养的有关知识； 学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 学习实验过程的详细描述及实验记录。 【实验原理】 细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点培养条件易改变和控制便于单因子分析便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察在生物学的各个领域如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等已被广泛应用。 细胞培养的局限性在脱离机体复杂环境下细胞培养条件与躯体环境有一定距离观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况细胞培养得到的产物少。 染色法鉴别细胞死活 细胞死活的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞，细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。 常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。活细胞必须通过控制物质进出细胞膜来保持内部环境的稳定性，细胞死后，细胞膜的通透性发生改变，原先不能够进入细胞的物质也能够进入细胞。台盼蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞受损或者死亡，才能进入细胞。因此，活细胞一般不能被台盼蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。 悬浮细胞计数（血细胞计数板法） 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的细胞计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽，构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图1)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3(万分之一毫升)。 计数时，通常数五个中方格的细胞总数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的细胞总数，然后再换算成1ml细胞悬中的细胞总数。 25个中方格的计数板，设5A，细胞悬液稀释倍数为B，则：1mL细胞悬液中的细胞总数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）。 图1?血球计数板构造示意图 【实验材料】 试剂：75%酒精、PBS液、细胞培养液、台盼蓝。 器具：超净工作台、解剖盘、镊子、剪刀、吸管、移液枪、玻璃培养皿、塑料培养皿、“L”型针头注射器、 火柴、酒精棉球、酒精灯、Eppendorf管、离心机、培养箱、记号笔、倒置显微镜、血细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、玻璃离心管，等。 材料：小白鼠 【实验步骤】 小鼠脾细胞原代培养 1.取材： 取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS