冰冻切片详细说明.doc

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冰冻切片详细说明

冰冻切片详细说明 切片技术最早期是从冰冻切片开始,后来逐步有了发展和更新,冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足,石蜡切片和火棉胶切片需时太久,且在制片中要使用许多化学试剂,石蜡切片还需要加温过程,因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等,可能被溶解和破坏。冰冻切片过程较简单,无须经过上述步骤,组织中的水分起着包埋剂的作用,组织经固定或不固定即可进行冰冻切片,切片厚度一般可在6-8微米,组织没有收缩,易保持生活时原有状态,是保存脂肪组织,许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法,特别是酶的活性十分理想的切片方法,对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断,冰冻切片也很重要。其缺点是组织过大不易冰冻,连续切片困难。5微米以下切片不易成功。但是随着现在冰冻包埋液的不断改进,已经能切出少于3微米的切片 一、直接冰冻切片法 冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。 1.恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。目前恒冷箱切片机的品种较多。此种切片适用于科研和教学上的连续切片。要求预先开动电源(预冷准备),配多种固定组织台,以便更换组织。 2.甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制,其冷却速度比较快,属于开放式,作一般常规冰冻切片用。 3.二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后,放在冰冻切片机的冷冻台上,加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关,二氧化碳气体喷出,待组织出现冷霜时,将二氧化碳关闭,即可切片。若组织冷冻过硬则切片易碎;组织冷冻硬度不足,则切片呈粥糜状,需用间歇方法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最合适,应迅速切片。 4.半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上,滴加少许蒸馏水,调好切片机的厚度。先接通热器的循环流水,然后接通电源,电源的正负极切勿接反,用整流电源控制温度。 二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织,特别是某些有树枝状突起的组织,当其切片后投入水中时,常常引起分散,甚至发生丢失,某些间隙较多的组织,有时会因发生散乱而失去相互间的联系,可形成移位现象。明胶冰冻切片正是适用于上述情况。 ⑴环保组织固定液固定后必须充分水洗,洗净。因甲醛对明胶有凝固作用,从而影响明胶溶液浸入组织内部,不宜选用含甲醛类固定液。 ⑵组织水洗后浸入12.5%明胶水溶液(以1%石碳酸水溶液配制),于37℃温箱浸6-24h。 ⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。 ⑷25%明胶包埋,连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固,取出后在空气中蒸发10min 。 ⑸入环保组织固定液固定明胶块1-2日。 ⑹蒸馏水洗后,置冰冻切片机或滑动式切片机切片。切片可保存于10%甲醛液中。 ⑺依检查目的而进行染色,染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明,而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片:果糖26g,明胶1.1g,钾矾0.75g,麝香草酚水溶液1.15ml。 先将果糖溶于麝香草酚饱和液,置于56℃温箱内12h,加明胶后在水浴内加温熔化, 过滤后加钾矾。于100ml溶液内加甲醛2ml防腐。 三、冰冻切片粘片法 1.蛋白甘油粘片法冰冻切片粘片法基本上按石蜡切片的粘片处理,但烘烤的温度不超过40℃。待烤干后立即取出,时间过久或温度过高则切片易破碎。烤干后用70%乙醇及蒸馏水洗后即可染色。 2.Lillie明胶粘片法将切片放入1%明胶水溶液数分钟,捞出置于载玻片上,将多余液体倾去。入环保组织固定液中固定5min,水洗10min,即可染色。 3.乙醇明胶粘片法切片浸入0.1%或0.75%明胶溶液(以40%乙醇配制)数分钟,捞于载片上,经室温短时干燥,入氯仿1min ,经95%及70%乙醇洗去氯仿,再经蒸馏水洗后染色。 四、冰冻包埋液包埋切片 OCT Compound 法 现在国内外有许多厂家用高分子材料配制成冰冻切片包埋液,将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘(chuck)上加少许包埋液,在其固化前嵌入组织块,然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。常规切片,厚度2-100微米。 或者在盛标本的包埋模具内,挤出适量冰冻包埋液,放入组织块或细胞沉淀块,加包埋剂完全淹没组织块,如有气泡可用针头或吸头吸出。速冻:将盛有组织细胞和包埋液的模具,正置于切片机冷室内冰冻10分钟,至包埋液固化。也可将盛有组织的模具置于液氮或-40-70度冰箱冰冻固化保存,用前取出置于切片机冷室内平衡温度(否则损坏刀片)。 冰冻包埋液是由高分子聚合物组成的透明粘稠液体,速冷时固化,其冰冻速度和软硬韧度与组织细胞相近,因此能保证最佳O.C.T.,并具有支持填充、减少皱褶和断裂的作用。能切出2-3微米的超薄切片。国内较好的品牌有西奈山冰冻包埋液。 冰冻切片——组织块的准备 1.调整好组织与刀片的方向 这是冰冻

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