核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用1.doc

核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用 摘要: 多糖功能复杂，有控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，作为无细胞毒性的免疫促进剂，已发展成为一种免疫方法,但是多糖由于结构复杂使解析结构非常繁琐和困难，使对各种多糖的深入研究受限。核磁共振波谱法(NMR)是解析物质结构最有效的手段，近年该技术的发展也很迅速。本文综述了一维核磁共振和二维核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用。这些技术可以提供如多糖的单糖组成、单糖残基间的顺序、单糖残基在糖苷键中的位置、环状结构的类型和糖苷键的构型等许多信息，成为分析多糖结构不可缺少的工具。 关键词: 多糖 核磁共振 一维核磁共振 二维核磁共振 多糖功能复杂，有控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，作为无细胞毒性的免疫促进剂，已发展成为一种免疫方法[1]。另外，在肿瘤、,血管、肝炎、糖尿病、甚至艾滋病等疾病方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[2]。 多糖功能是由其结构决定的。结构是多糖活性的基础，多糖一级结构的研究包括单糖残基的种类和顺序，多糖残基在糖苷键中的位置，环状结构的类型和糖苷键的构型。而组成多糖的单糖品种繁多，单糖的连接顺序、连接位置的不同以及是否存在侧链使多糖结构更具复杂性，其结构鉴定也更困难。目前常用的多糖结构分析方法主要分为化学分析法、生物学分析法和物理分析法3大类， 其中物理分析法包括核磁共振波谱(NMR)、红外光谱、质谱、x一射线衍射光谱等[3]。现将近年来核磁共振波谱在多糖结构分析中的应用进展作一综述。 1 1D NMR谱在多糖结构研究中的应用 1．1 1H NMR谱 对于多糖分子来说，由于不同糖残基中非异头质子的亚甲基和次甲基的化学位移非常靠 近，结果它的 H NMR谱峰严重重叠，大部分质子共振峰出现在δ 3．0～4．0的非常小的区域内，给解析带来困难。不在共振拥挤区的 H NMR信号被称为“结构信息共振信号”，是分析谱图的突破口。这种共振信号包括6位脱氧糖的甲基(H一6)和异头质子(H-1)，尤其是异头质子的信号对多糖结构的解析具有重要意义：一方面，其信号的线宽和积分可用于区别糖单元的类型及其相对含量；另一方面，也是最重要的一方面，可根据其化学位移和偶合常数的数值大小，来确定多糖结构中糖苷键的构型。通常 δ一糖苷的异头氢的共振比 一糖苷向低场位移0．3～O．5，前者一般出现在34．8～5．3处，而后者一般出现在4．4～4．8处。 同时，按Karplus关系，在n一构型中二面角为6oo左右，只能观察到H．1和H．2之间小的偶合( J=2-4Hz)，而在 β一构型中，H一1和H一2的反式竖键关系形成180的二面角，产生大的偶台( J =7-9Hz)。当然，这只是一般性的规律，不能一概而论[4]。如从真菌Termitomyces eurhizus的子实体中得到的葡聚糖PS-I， 1H．NMR中异头质子与邻位质子的J为3 Hz，表明其葡萄糖残基均为α构型[5]。解析图谱时一般先找出容易辨认的质子信号，如异头质子，再通过相同偶合常数的信号来确定其邻位质子。 1．2 13CNMR 微型计算机的脉冲傅利叶转换方法(F． r)在13CNMR上的应用，使得天然丰度很低的13C多糖能得到清晰的光谱 其化学位移范围远较1 HNIR 宽，达到200 ppm。目前，CNMFI在多糖结构分析上应用有：(1)异头碳的构型问题葡吡喃二糖异头碳的共振讯号位置，α型连接的为97～101ppm，B型连接为103～105 ppm (2)多糖残基中取代位置和分枝点的确定 在(1→6 )一α一D-葡吡喃糖残基连接的多糖组成中，若在2、3或4位羟基上未被取代，则C—l异头碳共振在9O～95 ppm，C-2、C-3、c4 或C-5共振在70～75 ppm，C-6在60～70 ppm共振，一般为62 ppm。若发生0-取代，在c—l异头碳位移到97～101 ppm，C-2、c一3、C4 或C-5 上的位移到76～85ppm．c-6共振移到68 ppm。(3)多糖中各残基种类和比例13CNMR的谱图上，不同糖残基的异头碳有不同化学位移，且峰相对高度正比于碳的数目，常借此确定糖基种类和计算不同残基的相对比例[6]。 Jansson等[7]设计的计算机程序CASPER，用于测定具有有序重复单元的多糖结构。该程序利用多糖的 13C．NMR及单糖和甲基化分析的信息，基于重复单元中单糖的特性和不同连接位置的差异，构建出所有可能的排序。借助从二糖获得的13 C—NMR化学位移数据，模拟出可供选择的结构波谱，从中筛选出与所测未知多糖波谱最一致的结构。该程序验证了2个已知多糖，均得到了正确的结构。后来发展的CASPER扩展版本，利用1H—NMR及2D—NMR的信息，可以测定具有分枝的复杂多糖的结构。验证了4个