8.细菌与病毒的微生物学检查法解析.ppt

病原体侵入机体后，其抗原性物质能刺激机体产生特异性抗体。存在于血液胡咯其他体液中的特异性抗体，随着病程的进展发生变化。用已知细菌或抗原检测病人体内是否产生相应的特异性抗体及其量的多少，病原菌感染的辅助诊断。通常称为血清学诊断（serological diagnosis).血清学结果作为诊断依据时，采集急性期和恢复期的双份血清，恢复期血清效价明显升高4倍以上时才有诊断意义。 * 电子显微镜能观察病毒颗粒的形态和大小。对含有高浓度的病毒颗粒（107以上）才能检测到。如果浓度达不到相关的要求，先将待检标本用特异性抗体进行凝聚后，再进行电镜观察。HIV，HBV及HAV都可以用电镜的方法检测。还有一个光镜显微镜。是来观察病毒感染细胞内的病理变化。比如包涵体及内基小体。病毒感染细胞后，在细胞质或细胞核内出现圆形或椭圆形的斑块，也就是包涵体（inclusion body).包涵体用Giemsa染色显示嗜酸性或嗜碱性的包涵体，对病毒性疾病的诊断有重要的意义。狂犬病病毒感染后，脑神经细胞质中可以检测出内基小体，可辅助狂犬病。 * 病毒必须在细胞内增殖，所以一般选用易感的活细胞对病毒进行分离培养和鉴定。常用的方法有动物接种、细胞培养和鸡胚培养。第一、动物接种,已经很少使用。现在基本已经被细胞培养所代替，但是，有些体外的细胞培养体系还没有建立起来的麻风杆菌目前还在沿用动物接种的方法。第二种：鸡胚培养： 二、检测病原菌成分 抗原的检测 核酸的检测 （一）抗原的检测 利用已知的特异性Ab检测Ag的方法 常用的方法有 玻片凝集 协同凝集试验 ELISA 免疫荧光法 ELISA （二）核酸检测方法 聚合酶链反应（PCR） 核酸杂交技术 Southern blot Northern blot Dot blot In situ hybridization 基因芯片(Gene chip) 16S rRNA 16sRNA基因序列分析 只存在于原核细胞型微生物的染色体基因中 16sRNA，23sRNA, 5sRNA 可变区和保守区 保守区：所有的细菌所共有 可变区：属和种的特异性 PCR Gene Chip 三、抗体的检测 用已知细菌或其Ag检测相应的特异性Ab及其量的多少，作为某些病原菌感染的辅助诊断 急性期和恢复期双份血清，恢复期效价升高≥4倍有诊断价值 方法 玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、 冷凝集试验、ELISA 局限 难以早期诊断 第二节 病毒感染的微生物学检查法 形态学 病毒的分离鉴定 在培养细胞中增殖的鉴定指标 病毒成分的检测 病毒抗体的检测 （一）病毒的形态学检查 电子显微镜（ EM） 免疫电镜, IEM 光学显微镜（CM） 包涵体 内基小体（Negri body） HAV Negri body 动物接种：动物模型 鸡胚接种： 9～14d 组织培养 器官培养 组织培养 细胞培养 原代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞培养 三大培养方法 （二）病毒的分离培养的方法 血凝抑制实验 中和实验 PCR检测 病毒分离培养及鉴 细胞病变（cytopathy) ※ 红细胞吸附 (hemadsorption) 病毒干扰作用 (viral interference) 中和试验 (neutralization test, NT) 空斑形成试验 (plaque formation) 病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标※ 细胞病变—细胞病变效应※（CPE） 细胞病变效应（CPE） A：未感染病毒的HeLa细胞；B：被柯萨奇病毒B3感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；C：被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列。?200 ?50%组织细胞感染量 TCID50: 根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标 细胞病变 红细胞吸附：血凝素（HA） 病毒干扰作用 中和试验 病毒数量及感染性的检测 空斑形成试验 红细胞凝集 红细胞吸附 病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标 plaque 空斑形成试验 用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用 一个空斑是由一个病毒大量复制而成，称为空斑形成单位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示 （三）病毒成分的检测 病毒抗原的检测: ELISA 病毒核酸的检测 核酸杂交、PCR、 基因芯片 病毒成分的检测 （四）病毒抗体的检测 中和试验（NT） 血凝抑制试验（HT） 补体结合试验（CF） ELISA法 蛋白印迹技术 小 结 细菌感染的微生物学检查法 病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测 病毒感染的微生物学检查法 电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定 核酸的检测 抗原、抗体的检测 小结 抗细菌免疫 固有免疫※ 获得性免疫 抗病毒免疫