乳酸菌的分离培养..doc

乳酸菌的分离培养 保加利亚乳杆菌1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察； 2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术； 3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。 4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。 5.了解酸中乳酸菌分离原理。了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体酸奶中含有乳酸菌，而目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。 实验器材： 样品：含乳酸菌的酸奶培养基：改良MRS固体培养基蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL乙酸钠2.5gK2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL 琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。仪器用品： 00ml烧杯一个00ml量筒一个 无菌培养皿12个 250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只15ml试管7只高压灭菌锅天平水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺牛皮纸麻绳接种环一个盖玻片酒精灯一盏牛角匙pH试纸血球计板载玻片若干恒温培养箱酸度计擦镜纸吸水纸液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯火柴、滴管药品：结晶紫，乙醇，草酸，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl10％NaOH2%氯化铁。药品配制结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1草酸0ml。将两液混匀即。卢氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取0ml与80ml蒸馏水混匀即可。0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。生理盐水：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。1．称量 用天平称取蛋白胨g, 牛肉膏g , 酵母提取物.5g ,柠檬酸二铵g,乙酸钠.5g , K2HPO4 0.2g, MnSO4·4H2O 0.025g, MgSO4·7H2O 0.06g , 葡萄糖g , 吐温800.1mL , CaCO3 1g放入烧杯。 2．溶解 向上述烧杯中加入蒸馏水50 mL无菌水 在石棉网上加热溶解2.5g琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。 3．调节pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸测pH，直到pH到6.8 4．过滤 要趁热用四层纱布过滤 5．培养基的分装 将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜) 培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。 7．包扎 在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名 二、灭菌 1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。 2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。（注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果）。 3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。（以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气）同时关闭灭菌锅上方的安全阀，打开排气阀，使水沸腾时得以排除锅内的冷空气。 4．设置灭菌温度和时间。温度为121℃,20分钟灭菌 5．排出锅内的冷空气，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内的压力上升到98kPa时，控制火力大小，使压力维持在98k