实验七__胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇.doc

生物化学与分子生物学设计实验 （胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素） 小组成员： 班级：麻醉11-2班 日期：2012年12月19 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素 实验目的 1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。 2、学习用法测定血清尿素进一步熟练的1、氧化酶法测定总胆固醇的原理 2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理 一、实验原理 （一）氧化酶法测定血清总胆固醇 血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。 第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸 (FFA) 。 第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。 第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生 成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。 （二）二乙酰一肟法测定血清尿素 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 二、操作步骤 （一）氧化酶法测定血清总胆固醇 终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。 酶法测定TC操作步骤 加入物(μl) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 20 标准液或定值血清 － 20 － 蒸馏水 20 － － 酶试剂 1 000 1 000 1 000 混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。 （二）二乙酰一肟法测定血清尿素 取试管3支，按下表依次加样。 二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.02 尿素标准应用液 － 0.02 － 蒸馏水 0.02 － － 二乙酰一肟溶液 0.5 0.5 0.5 酸性试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。 三、注意事项 （一）氧化酶法测定血清总胆固醇 1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致； 2、比色应在30min内完成； 3、试管在操作前尽量保持干燥； 4、试剂中酶的质量影响测定结果 ； 5、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。 （二）二乙酰一肟法测定血清尿素 1、试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，(每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后，应及时比色。 2、尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。 3、注意洁净干燥，加量务必准确。 4、水浴时注意打开水浴箱盖，以免水汽入管。 5、酸性试剂中酸的含量较浓，要小心使用。 四、思考题 1. 血清胆固醇浓度升高或降低有何临床意义？ 2. 血清尿素浓度升高或降低有何临床意义？ 3. 血清非蛋白氮(NPN)与尿素的区别，它包括哪些？ 小 结 氧化酶法测定血清总胆固醇，此方法特异性好和灵敏度高，既可用于手工操作，也可自动化分析；既可作终点法检测，也可作速率法检测。在终点法中血红蛋白高于2g/L时引起正干扰；胆红素高于0.1g/L时有明显负干扰；血中维生素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。但是在速率法中上述干扰物质影响较小。高TG血症对本法无明显影响。检测TC的血清(浆)标本密闭保存时，在4℃可稳定1周，－20℃可稳定半年以上。 二乙酰一肟法测定血清尿素，试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。线性上限仅达7.14mmol/L；回收率为96%～102.1%。二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171μmol/L、血红蛋白达10g/L均无影响。