HIV核酸检测技术及应用解析.ppt

应用实例1——窗口期病例 某年某月某疾控送检一份HIV筛查阳性标本（MSM）。 ELISA阳性，硒标阳性WB确证gp160,p24。 两周后随访， ELISA阳性，硒标阳性， WB确证gp160,p24。病毒载量51000 cp/ml。 一月后再抽血复检，ELISA阳性，硒标阳性， WB确证gp160,gp120,p66,p51,gp41,p31,p24,p17。HI病毒载量120000cp/ml。 应用实例2——晚期AIDS病人样本 某年某月，某医院送检一份疑似HIV感染的样本，有机会感染的住院病人。 第一次检测ELISA阴性，报HIV抗体阴性。 临床医师要求确证试验，第二次检测，ELISA和硒标均为阴性，WB：gp160,p66, p51 ，不确定。病毒载量7500 IU/ml。CD4:9个/μl 一个月后复检ELISA和硒标仍为阴性， WB：p24±, p51±,p66±，病毒载量164000 IU/ml。 有艾滋病的临床表现，结合临床表现最终临床诊断为艾滋病。进行抗病毒治疗一月内此病人已死亡 应用实例3——婴幼儿早期诊断 某婴儿2012年8月出生，双亲均为HIV感染者，孕3月行母婴阻断 44天第一次核酸检测为阳性 177天第二次核酸检测为阳性 出具”婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性” HIV核酸定量检测 HIV病毒载量(Viral Load) 指体内复制的病毒的数量，反映体液（一般是血浆）中HIV病毒的含量 1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。 是HIV核酸的定量检测，一般以血浆HIV RNA的拷贝数/ml表示 常用的HIV病毒载量检测方法 主要核酸扩增和信号放大扩增两种方法 NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃) Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏) m2000(Abbott，雅培) bDNA/Versant 440 (西门子) 国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰 丽珠、科华等 NucliSENS EasyQ 血浆样本 miniMAG easyMAG 病毒载量分析仪 引物 2 NASBA扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖性扩增法） 逆转录酶 逆转录酶 T7 RNA聚合酶 逆相 RNA 扩增物 RNase H 引物 1 引物1 延伸 RNase H 和 引物 2延伸 RNA T7 RNA 聚合酶 逆转录酶 逆转录酶 “分子信标” 杂交 AMV-RT (鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成RNA-DNA 杂交链 RNase H:降解杂交链中的RNA T7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物 T7启动子序列 COBAS? AmpliPrep? / COBAS? TaqMan48 COBAS? AmpliPrep? / COBAS? TaqMan48? 系统 完整探针: 报告基团 (R) 的荧光被淬灭基团(Q)抑制 h? 引物 引物 R Q 探针被5’-外切核酸酶切掉 Q R 报告基团的荧光发射 h? Q R R = 报告基团 Q = 淬灭基团 TaqMan水解探针技术 雅培HIV-1病毒载量仪 m2000全自动实时荧光定量PCR系统 HIV-1病毒载量自动化检测平台（96通量） 已认证用于干血斑病毒载量检测 婴儿HIV-1核酸检测试剂盒 用于实验室in-house方法的自动化核酸提取 此平台同时有HBV病毒载量，HCV病毒载量及分型，HPV高危分型，MTB检测，CT/NG检测等试剂盒 bDNA (Bayer versantTM) 核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！ 人工加样 试剂分装 自动化提取 人工配液 PCR仪检测 临床式半自动使用方案 北京万泰生物药业股份有限公司 PCR仪结果导入 WanTag 全自动核酸提取仪 PCR检测 HIV核酸定量检测试剂-全自动化平台 强强联合整合Tecan加样与Thermo核酸提取平台 高通量 同时可用，实现1h内96份样本的提取 高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、PCR试剂配制与分配等扩增前的所有操作 采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染 中文自主操作界面，方便快捷 达安基因HIV病毒载量核酸检测系统 HIV-1核酸定量检测试剂盒 全自动核酸提取仪 DA3200 国产化！全自动！ PANTHER系统——TMA（转录介导的等温扩增） 简易的工作流程：“上样”直接到“结果”，3.5小时得到第一个样本结果，每分钟一个结果，12个小时500个样本 核酸检测在新版规范主要内容 新增补充试