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表达型载体 2009-3-5 15:36:02 　　前面已经介绍了基因工程中常用的几种载体系统，包括质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体和M13克隆载体等等。这些载体都由三个基本组成部分——复制基因、选择标记基因和克隆位点组成。只要具备这三个部分，就可以在基因工程中大显身手。为了使这些载体更有利于外源DNA片段插入后的筛选工作，不断地引进优秀的选择标记基因，使重组载体分子导入寄主细胞后，寄主细胞可以迅速地表现出抗药性、颜色变化或者其它的表型特征的改变。为了DNA操作更方便，不断地将克隆位点由单限制酶位点发展成多克隆位点，更有甚者，将克隆位点区的整个核苷酸序列方向变成相反方向，制造出一对一对仅仅只是多克隆位点区取向相反的载体体系。大部分的改良工作几乎都围绕这几个方面。 　　但是我们讨论的，仅仅限于用这些载体在较短的时间内获得大量的DNA片段。至于能否获得基因产物，得到基因编码的蛋白质产物，基本上尚未涉及。获得基因，除为了分析这个基因外，另外一个重要目的是为了利用这个基因获得这个基因的产物，这需要使该基因实现表达，这正是本节讨论的内容。 　　1．基因表达的基本过程 　　在这里所指的基因表达过程是指遗传信息从DNA到蛋白质的整个过程。从“基因与基因工程”一章中已经知道，这也是中心法则所描述的遗传信息流的过程，它包括转录和转译两大阶段。 　　转录是基因表达的第一步，是遗传信息从DNA分子转移到RNA分子的过程。实质上就是RNA分子的生物合成过程。转录过程是以DNA分子中的一条转录链为模板，在RNA聚合酶的催化作用下进行的一系列的RNA的合成反应。 　　在“基因与基因工程”一章中我们提到过基因结构。如果我们把乳糖操纵子结构简单化，可以把它看成由5′端的操纵子结构和随后的基因编码区两大部分组成。基因编码区对应着蛋白质的各个氨基酸。5′端的操纵结构是基因的非编码区，对基因表达过程起着重要的控制作用。它主要由操纵子和启动子组成，又叫做启动子区。 　　转录的过程恰如一场“田径赛”。参赛的“运动员”就是RNA聚合酶，其最好的“成绩”就是合成出完整的RNA分子。“运动员”何时可以自由活动，何时开始进入跑道，又何时开始起跑，整个的过程必须听从“裁判员”的指挥。 　　转录的起始是整个过程的第一步。基因转录起始的“信号”全部储存在基因的启动子区内。RNA聚合酶可以随机地与基因的所有的部分结合，但都是十分松散的结合，不妨碍任何基因活动，但一旦同基因的启动子结合，RNA聚合酶马上就进入“工作状态”，在启动区“整装待命”。根据性能的不同，基因启动子区还可以细分为RNA聚合酶的识别位点、结合位点和其它的一些信号序列。绝大多数原核生物的启动子结构都十分相似。一般认为它的识别序列是-35序列，是结合RNA聚合酶的起始位点。RNA聚合酶一旦识别-35序列，就与启动子紧密结合，并逐渐滑向另一个结合位点即-10序列。-10序列与转录起始位点间的距离为5—10个碱基，基本上都是由TATAATG碱基序列组成，特称为TATA盒，又叫作Pribnow盒。-10序列是给RNA聚合酶定向的序列，使RNA分子的合成按从5′→3′的方向进行。同时在这个区段内，DNA双螺旋结构被打开，形成开放型的启动子复合体。直到这时，启动子给RNA聚合酶的“口令”才是“开始”。 　　接着，RNA聚合酶就按照DNA模板合成RNA。基因编码区的3′端还有一段非编码序列，这里储存的是转录的终止信号。到了终止信号，完整的mRNA就形成了。转录过程是需要能量的，RNA聚合酶转录到终止信号处，就会“自觉”地终止转录作用，否则会造成浪费，生物体从来不干这样的傻事。 　　基因表达的第二步是转译，是mRNA分子指导蛋白质多肽链合成的过程。转译进行的场所是核糖体。核糖体是一种多组分的细胞质颗粒，含有多种蛋白质合成酶。转译的起始就是核糖体与模板mRNA分子进行识别结合的过程。核糖体内含有rRNA。核糖体依靠rRNA识别mRNA上的核糖体识别序列并与之结合。在大肠杆菌中核糖体识别序列称为SD序列。 　　核糖体与mRNA结合以后就正式开始蛋白质的合成。由起始tRNA运载着起始氨基酸与mRNA上基因的起始密码子“相会”，并在此留下起始氨基酸。接着，下一个氨基酸密码子被带有该氨基酸的tRNA的反密码子识别，同样留下一个氨基酸。被留下的两个氨基酸在核糖体的蛋白质合成酶的作用下形成肽键。转译过程一直按照模板的密码子进行到最后，合成出基因编码区相对应的多肽链。转译的过程又叫做读码的过程，因为tRNA必须要读出模板mRNA的密码子，才能不断地合成出多肽链。所以人们又把基因的编码区叫做开放阅读框架。 　　2．基因启动子和表达型载体 　　从上述基因表达的基本过程，可以看到基因的启动子对基因表达所起的巨大作用。同时也可以看到只要RN