南医生化实验报告5..doc

生物化学实验报告 一、实验目的实验原理离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的交换。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂，带负电的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素带正电荷，是一种阴离子交换剂。脱盐后的蛋白质溶液中尚有各种球蛋白，因此可以利用它们等电点不同进行分离。具体原理如下： （1） （2） （3） 醋酸纤维素薄膜电泳法对血清蛋白进行纯度鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素做固体支持物的电泳技术。该薄膜具有均一的泡沫结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动阻力小。蛋白质是兼性离子，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有清蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等蛋白质，每种蛋白质均具有其不同的等电点、氨基酸立体构象和相对分子质量（见下表），因此在同一电场中也具有不同的泳动速度。据此分离后将薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色，可见清晰的条带。 蛋白质名称 等电点 相对分子质量（×104） 清蛋白 4.88 6.9 α1-球蛋白 5.06 20 α2-球蛋白 5.06 30 β-球蛋白 5.12 9-15 γ-球蛋白 6.85-7.50 15.6-30 用此方法分离的蛋白条带从阳极至阴极的顺序为：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。 三、材料与方法 四、结果与讨论清蛋白 4.88 6.9 α1-球蛋白 5.06 20 α2-球蛋白 5.06 30 β-球蛋白 5.12 9-15 γ-球蛋白 6.85-7.50 15.6-30 血清中含有清蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等蛋白质，每种蛋白质均具有其不同的等电点、氨基酸立体构象和相对分子质量（见下表），因此在同一电场中也具有不同的泳动速度。据此分离后将薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色，可见清晰的条带。根据上图数据分析，用此方法分离的蛋白条带从阳极至阴极的顺序应为：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。 因此可以根据各蛋白质条带的位置与样品健康人血清各蛋白质条带的位置对比来确定γ-球蛋白和清蛋白。 判断纯度的依据是：若分离提纯得到的清蛋白和γ-球蛋白各仅有一条蛋白质条带，其他位置没有条带，则为杂质较少，纯度较高。  清蛋白及α、β球蛋白的pI＜6.5 ，带负电荷； γ–球蛋白pI＞6.5。 、】】＞6.5，带正电荷。 往离子交换柱中加入0.02mol/LNH4Ac，pH=6.5。 清蛋白及α、β球蛋白被层析柱吸附；γ–球蛋白被洗脱。 清蛋白pI=4.9，带负电荷多； α、β球蛋白pI为5.0～5.2，带负电荷少。 往离子交换柱中加入0.06mol/LNH4Ac，pH=6.5。 清蛋白仍被层析柱吸附；α、β球蛋白被洗脱。 缓冲液离子强度增加。 往离子交换柱中加入0.3mol/LNH4Ac，pH=6.5。 清蛋白被洗脱。 取0.8ml血清，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min。 沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解。 上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）约0.8ml。 将样品过SephadeG-25凝胶柱（1cm×7cm）。 将样品过SephadeG-25凝胶柱。 用1ml0.02mol/L NH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁。 用1ml0.02mol/L NH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁。 继续用2ml 0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml。 继续用2ml 0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml。 磺基水杨酸检测蛋白质至呈阳性反应，收集含有蛋白质的峰液12d。 磺基水杨酸检测蛋白质至呈阳性反应，收集含有蛋白质的峰液12d。 层析柱所剩溶液可能磺基水杨酸和BaCl2检测同时呈阳性，故继续用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗涤约2ml，直至BaCl2检测SO42-呈阴性。 层析柱所剩溶液可能同时磺基水杨酸和BaCl2检测呈阳性，故继续用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗涤约2ml，直至BaCl2检测SO42-呈阴性。 用2-3ml0.02mol/L NH4Ac缓冲液再生平衡。 用2-3ml0.02mol/L NH4Ac缓冲液再生平衡。 离子交换柱层析纯化。 除盐后收集的清蛋白。 除盐后收集的球蛋白。 过DEAE-纤维素层析柱。