南医微生物实验报告..docx

脓汁和粪便标本中病原菌的检测[摘要]脓汁和粪便标本中有不同的病原菌。为了探究两种标本中病原菌的种类、特性和生化反应等，本实验将对脓汁和粪便中的病原菌进行分离培养、革兰染色、生化反应、血清学反应、细菌药物敏感性试验等操作。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等操作方法。从而达到掌握各种微生物实验的操作方法，培养对微生物实验的兴趣，反思微生物实验中所遇到的问题并总结探讨如何解决优化的目的。[引言] 常见的化脓性病原菌有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌等。 临床上，脓汁标本在做细菌分离培养的同时，须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据；粪便和经离心的尿沉淀物等则直接接种与指定的培养基中。 粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、大肠埃希菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如SS琼脂、伊红-美蓝平板等），选择培养基时应根据需要尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。本实验通过常规的病原菌检测方法从脓汁标本中分离出黄白两种细菌，均为革兰氏阳性球菌，其中黄色是致病菌—金黄色葡萄球菌，白色是白色葡萄球菌；从粪便标本中分离到紫黑色和粉红色的细菌，均为革兰氏阴性杆菌，其中紫黑色的是大肠埃希菌，粉红色的是痢疾志贺菌。1.实验材料1.1器材 酒精灯、接种环、接种针、打火机、试管、棉塞、油性笔、污物盘、普通冰柜、奥林巴斯 CX21型生物显微镜、拭镜纸、称量纸、药勺、牛皮纸、电炉、橡皮筋、锥形瓶、刻度尺、镊子、玻片、吸水纸、培养皿、高压蒸汽灭菌器、隔水式电热恒温培养箱等。1.2 试剂药品 脓汁标本、粪便标本、营养琼脂、营养肉汤、半固体琼脂、普通营养琼脂培养基、伊红-美蓝培养基、斜面琼脂、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释品红、香柏油、拭镜油、葡萄糖微量发酵管（2支）、乳糖微量发酵管（2支）、青霉素抗菌素纸片、先锋霉素Ⅴ抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、蒸馏水、生理盐水、兔血浆、福氏志贺菌诊断血清等。2.实验方法与步骤实验的总流程：培养基的制备→细菌的分离培养→细菌的纯培养→细菌的形态学检查→细菌的生化试验等→细菌的血清学试验、结果分析2.1培养基制备营养琼脂培养基营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀→加热溶化→高压蒸汽灭菌→倒平板分装→琼脂完全凝固后，平板倒放→4℃冰箱保存备用斜面培养基营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀→加热溶化→高压蒸汽灭菌→倒试管分装→培养基趁热斜放→琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用2.2空气与人体体表细菌学检查2.2.1空气的细菌学检查实验方法自然沉降法:根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（ Colony-Forming Units，CFU），可了解空气的污染情况。实验步骤每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间、走廊等）→将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15分钟→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24小时→观察结果2.2.2人体体表的细菌学检查实验步骤甲常规洗手，乙标准洗手，甲和乙共用1个平板。按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。2.3 细菌的分离培养2.3.1实验方法平板划线法：借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。2.3.2实验步骤接种环烧灼灭菌→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和伊红美蓝平板上，各做两份→烧掉接种环上多余的脓汁或粪便标本→冷却后，使用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）→接种环烧灼灭菌→将平板倒置37℃培养18～24h→观察结果2.4细菌的群体生长特性观察和纯化培养2.4.1实验方法斜面接种法：是一种从已经生长好的菌种中挑取少量菌种移植到另一个斜面培养基的饭方法。该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用灭菌的接种环取单个菌落或少许细菌，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端。2.4.2实验步骤接种环烧灼灭菌→挑选平板上典型的四种单菌落（白色、金黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养→做好标记→接种环烧灼灭菌→斜面培养基置于37℃培养过夜→保存备用2.5细菌的个体形态特征的观察2.5.1实验方法:革兰氏染色法和肉汤接种法2.5.2实验原理革兰氏染色法：G＋菌的细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一