南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆..docx

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘 要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α (克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015- ~2015-实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期实验目的学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤实验原理pEGFP-N1质粒T载体材料与方法：实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子实验具体流程获取外源基因碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒彻底弃上清弃上清菌液离心1300r pm,1min瞬时离心加350μl 溶液S3加250μl 溶液S2加250μl 溶液S1漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀取上清600μl加到吸附柱中离心13000rpm,10min颠倒数次离心放置3-5min13000rpm,1min弃滤液，加入600μl洗涤液W弃滤液，加入600μl洗涤液W离心离心放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40μl洗脱液13000rpm,1min13000rpm,1minPCR扩增 / -20℃保存备用弃滤液空柱离心离心13000rpm,2min13000rpm,1minPCR扩增目的基因GFP取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O6l质粒DNA（pEGFP-N1）2l引物GFP1 (10M)1l引物GFP2 (10M)1lPremix Taq10l总体积20l加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。PCE参数设置： 94℃预变性5分钟后开始以下循环94℃ 30 秒 56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 72℃ 7 分钟4 ℃ 保温琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上样（1mlPCR产物，6l loading buffer混合点样）→点marker→电泳→取出凝胶→拍照构建重组DNA使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。按下表加入试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组①对照组②即用型蓝白T载体1 l1 lPCR扩增产物1 l—Control Insert DNA—1 l快速连接缓冲液(2X)5 l5 l超纯水-ddH2O2.5 l2.5 lRapid T4 DNA ligase0.5 l0.5 l总体积10 l10 l添加完成后，冰箱内16℃反应45分钟重组DNA的转化预先制备好感受态细胞。转化DNA，为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组：10l PCR产物/蓝白T载体连接产物+ 100l感受态细胞阳性对照组：10l Control Insert DNA/蓝白T载体连接产物+100l感受态细胞阴性对照组：10l无菌双蒸水 + 100l感受态细胞步骤：（分别制作3组）将10lDNA和100l的感受态细胞加入试管中→冰浴30min→42℃水浴精确90s→迅速转移至冰浴冷却1-2min→加入800lLB培养基→恒温培养箱中37℃培养45min检测重组DNA：涂布平板筛选步骤：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素（Amp、X-gal、IPT