原液稳定性补充..docx

重组人白细胞介素-12原液初步稳定性研究1. 试验对象1.1 实验对象广州市恺泰生物科技有限公司生产的重组人白细胞介素-12（rhIL-12）原液。1.2 试验试剂及仪器见附录一。重组人白细胞介素-12（rhIL-12）原液批号为2. 试验内容2.1 考察在生产贮存过程中对rhIL-12原液稳定性的影响因素rhIL-12的分离提纯都处于液体状态，这对蛋白分子极不稳定，纯化后需在低温（-80℃）冷冻贮存。在原液检测及生产成品过程中，需要在室温和2～8℃的条件下操作，并且样品需要自冷冻状态下解冻为溶液，故考察室温、2℃～8℃的条件下原液的稳定性及反复冻融对rhIL-12原液的蛋白含量、生物活性及纯度影响。试验过程中样品采用15ml无菌离心管包装，批号2.1.1 温度对rhIL-12原液稳定性的影响取样品分别放置于室温（实验室温度控制在21℃～26℃之间）、2℃～8℃（4℃冰箱）。室温放置的样品在第0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h取样检测，4℃放置的样品在0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d和15d时取样检测。进行样品的蛋白含量、生物活性、HPLC纯度和电泳纯度测定，并分析这四个指标随时间的变化情况，样品出现明显变化后，停止取样检测。2.1.2 多次冻融对rhIL-12原液稳定性的影响rhIL-12原液在-80℃、4℃冻融多次，取样进行蛋白含量、生物活性、HPLC纯度和电泳纯度测定，并分析这四个指标随时间的变化情况。3. 考察项目的检测方法3.1 蛋白含量方法见附录四，参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》，蛋白含量标准应为0时的80%-120%。3.2 生物活性具体步骤见附录二，参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液生物活性检定标准，以国际参考品作为参考品，计算比活性，检测各取样点比活性不低于0时比活性的80%为合格。3.3 高效液相色谱法（HPLC）纯度检测HPLC纯度检测方法见附录三（二）。参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液纯度检定标准，纯度不低于95%为合格。3.4 电泳法（非还原SDS）纯度检测非还原SDS纯度检测方法见附录五。参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液纯度检定标准，纯度不低于95%为合格。3.3 数据处理比较每批样品各取样点的蛋白含量、比活性和0时的蛋白含量、比活性，分析样品的蛋白含量和活性变化。用重复测量的方差分析法，比较样品随时间变化的蛋白含量和生物活性差异，多重比较采用LSD法。使用SPSS13.0软件进行处理，数据以表示，显著性为P0.05。4. 结果4.1 影响因素试验结果4.1.1 温度对rhIL-12原液影响不同温度条件下，各时间点样品的蛋白含量、生物活性和纯度的检测结果见表1、表2及附图1、图2、图3、图4。表1. 室温放置对rhIL-12原液蛋白含量、比活性及纯度影响结果（，n=6）放置时间比活性（×106IU/mg）含量（ug/ml）HPLC纯度（%）电泳纯度（%）实测是否合格实测是否合格实测是否合格实测是否合格0h9.57±0.16合格198±18合格99.90 合格99.9合格1h9.57±0.68合格197±13合格98.75合格99.9合格2h9.95±0.30合格198±20合格97.44合格99.9合格4h9.74±0.64合格190±09合格98.86合格99.9合格8h 7.68±0.75**合格191±13合格98.56合格99.9合格24h 6.55±0.23**不合格200±17合格99.00 合格99.9合格48h 4.35±0.32**不合格206±16合格98.92合格99.9合格注：**：与0h时比较P0.01。由表1可知，室温下放置的样品，与0时样品比活性相比，8h、24h和48h时样品的比活性有显著性差异（P0.01），而1h、2h和4h时的样品无显著性差异，说明rhIL-12原液室温条件下放置8h后比活性开始下降，但不低于0时比活性的80%，仍合格，至48h时已下降超过50%；样品在各个取样时间点的蛋白含量和纯度均合格。表2. 4℃放置对rhIL-12原液蛋白含量、比活性及纯度影响结果（，n=6）放置时间比活性（×106IU/mg）含量（ug/ml）HPLC纯度（%）电泳纯度（%）实测是否合格实测是否合格实测是否合格实测是否合格0d9.67±0.19合格204±18合格98.63合格99.9　合格1d9.41±0.12合格199±13合格99.31合格99.9合格2d9.53±0.30合格199±20合格95.10合格99.9合格3d9.34±0.26合格193±10合格96.15合格9