[1豆瓣生产工艺.docxVIP

1豆瓣中微生物的分离采用平板稀释分离法筛选豆瓣中的细菌。称取豆瓣样品10g，放入装有90ml灭菌的生理盐水三角瓶中，120r/min约20min，使样品与水充分混合，将菌分散得到10-1豆瓣悬浮液。取1ml土壤悬液注入9ml无菌水的试管中，震荡混匀得到10-2菌悬液。依次制作10-3、10-4悬浮液，吸取 0.2 ml 10-1、 10-2、10-3、10-4土壤悬浮液分别涂布于供试分离培养基上，每个浓度设置三个重复并编号。分别在30℃、37℃倒置培养1-7天后观察菌落形态进行菌落统计[12]。2.豆瓣中微生物的纯化配制纯化培养基，121℃高压灭菌30 min。用无菌竹签挑取分离培养基上的细菌单菌落，采用划线法在纯化培养基上进行纯培养，在对应问下的培养箱中培养1-7天[13]。3.菌种保藏挑取纯培养得到的细菌菌体分别置于无菌的30%的甘油管和20%牛奶管中，用无菌竹签将其尽量捣碎使其充分分布在甘油和牛奶中并加以标记，用真空冷冻干燥机将牛奶管冷冻干燥后封口。把保存好的甘油管和封口的牛奶管放在-20℃冰箱中长期保存。注：① 20%甘油制备，500 ml：量取100 ml丙三醇于烧杯中，加入双蒸水400 ml，充分混匀。取1 mL到冻存管中，121℃高压灭菌30 min后便制成甘油管，放入-20℃冰箱备用。②20%牛奶配制，100 ml：称取脱脂牛奶粉20 g，加入100 ml双蒸水中，加热充分溶解。吸取400μL加入安瓿管（2.5 mL），塞上棉塞，115℃灭菌15 min。放入-20℃冰箱备用。4.菌种DNA的提取DNA提取步骤如下。（1）培养3ml细菌至饱和状态，取1.5ml，10000rpm离心2min，弃上清，加ddH2O洗涤，10000rpm离心2min，弃上清液。（2）沉淀物加入555μLTE buffer，6000rpm震荡，使其充分悬浮。加入40μL 10％ SDS和5μL 20mg/mL蛋白酶K，振荡混匀，37℃温育2h。（3）加入100μL 5M的5MNaCl，混匀，再加入80μL CTAB/NaCl（水浴预热）溶液，混匀，65℃温育15min。（4）加入780μL24：1氯仿/异戊醇混合液，混匀，4℃，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管。（5）加入等体积的25：24：1 酚/氯仿/异戊醇（取下层溶液），混匀，4℃，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管。（6）加入0.6体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃静止30min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，500μL70％乙醇洗涤，4℃，12000rpm离心10min，弃上清。（7）真空干燥10~30min，加入TE bμffer35μL溶解。5.基因组DNA的检测：DNA浓度的测定组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值波长为250nm～270nm之间。碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收底谷在230nm，这个物理特性为测定核酸溶液的浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度50μg/ml；单链DNA或RNA 40μg/ml；单链寡聚核苷酸20μg/ml。由此可以计算核酸样品的浓度。同时还可以通过测定260nm和280nm的吸光度的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明DNA样品中RNA未除尽。RNA，DNA溶液中含酚和蛋白质将导致比值降低。270nm有高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA 的DNA溶液比值为1.8的情况，因此必须结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA或用测定蛋白质的方法检测是否有蛋白质存在。紫外分光光度法只适合用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。取5μl DNA样品加入95μl无菌的超纯水，混匀，转入分光光度计的石英比色杯中，分别在260nm和280nm测定样品的吸光度，测定前先用无菌超纯水校正零点。读出260nm和280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50/1000[43]；浓度单位μg/μl。6.DNA片段大小测定的方法如下。带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。自1937年首创电泳技术以来，电泳已成为了分子生物学中的重要技术手段。其中凝胶电泳由于其操作简单，快速灵敏等优点使它成为了分离鉴定和提纯核酸的首选的标准方法。影响电泳迁移率的因素有核酸分子的大小、胶浓度和DNA构象，其中凝胶浓度对分离核酸影响较大。表1 凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围琼脂糖（%）线性DNA片段的有效分离范围（kb）0.530～10.712～0.81.010～0.51.27～0.41.5