总RNA的提取与RT、Realtime-PCR.doc

总RNA的提取与RT、Realtime-PCR 总RNA的提取与RT、Realtime-PCR 一、实验原理 RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。 由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。 1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶 但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。 外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。 2．常用的RNA酶抑制剂 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 *异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。 *氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。 *RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。 *其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNase也有一定抑制作用。 3．防止RNase污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作 *尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。 *操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。 尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，