太湖水体富营养化 DGGE 指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化.doc

太湖水体富营养化 DGGE 指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化 导读：就爱阅读网友为您分享以下“DGGE 指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对92的支持! 增，且目的产物量最大而非特异性产物量最少的退火温度。在上述情况下，使用降落PCR 能够很好地解决这个问题。退火温度是影响PCR 特异性的重要因素。第一步变性后温度快速冷却至40～60之间，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸，G+C 含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。退火温度的范围可跨越15，从高于Tm 5至低于Tm 10左右，条件允许的话，退火温度可以1或0.5递降。退火温度的选择体现在降落PCR 中就是降落的起始温度的选择。综合大量参考文献[]的PCR 反应程序，把退火起始温度设为65，并且设计对比试验进行验证。采用5 种不同的退火温度，起始温度分别为65、66、67和68，每个循环降低0.5，20 个循环后降低10，然后稳定在该温度继续增加几个循环。每一组中设 有3 个平行样，加入的模板浓度不同，分别为50 倍稀释液、100 倍稀释液和空白对照。PCR 产物的电泳检测结果见图3-6。 从图3-6 上可以看出，随着起始温度的升高，PCR 产物的量变得越来越少，表 现为条带越来越暗，这也证明了退火温度太高的情况下PCR 反应较难进行。同时，温度升高后，PCR 产物的特异性并没有明显的改善。综合以上分析，本实验中最为合适的起始退火温度为65。随着循环数的增加，PCR 人工产物产生的频率会越来越大。特别是针对细菌通用引物，由于它的扩增对象非常广泛，控制合适的循环数是保证PCR 产物特异性的重要手段。实验初期，降落PCR 的循环数采用20+15 的组合，结果(图3-7)表明目标条带的特异性不好，表现为条带较粗，拖尾现象严重，且引物二聚体条带亮度很高。 后续DGGE 实验得到的结果也不佳，图谱干扰条带很多，背景杂乱，加样孔附近的亮度很高。将反应循环数改为20+10 和20+5 的组合，结合PCR 产物电泳图谱和DGGE图谱进行综合分析，可发现20+5 组合得到的DGGE 图谱效果最佳。 经过上述大量的试验表明，PCR 产物的特异性对于DGGE 实验的效果具有关键 性的影响。以后在进行相关DGGE 实验前，建议对PCR 反应的各个条件先进行仔细的确定，确保PCR 产物具有较高的特异性。因为DGGE 实验的费用比较昂贵，这样可以避免无效的DGGE 实验的次数，节约成本。最终，本实验中确定的PCR 反应条件见2.5 节内容。18 个样本的PCR 扩增产物电泳检测图见图3-8。 为了提高PCR产物的特异性，很多研究都在这方面做出了努力。Qin等[46]采用 5%的非变性丙烯酞胺凝胶进行PCR产物同源双链纯化。这是基于异源双链的迁移速度比同源双链慢，但是比单链快的原理。Thompson等[47]利用修补PCR (Reconditioning PCR)的方法降低异源双链和单链分子的产生。该方法是样品在20个循环的扩增后，产物进行10倍稀释作为模板，在新的反应液中重新进行3个循环的修补扩增。由于引物相对模板的浓度较大，可以