westernblot实验步骤(最终版revised)..doc

Western blot 免疫印迹标准流程 仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。 杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制： （一）母液 ?1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至100ml，高温灭菌后室温下保存。 PH加HCl的量 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g 蒸馏水至 1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 1M Tris/HCL(pH8.8)(分离胶用，HCL调pH值) Tris 12.114g 双蒸水 100ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至100ml，高温灭菌后室温下保存。 1M Tris/HCL(pH6.8)（浓缩胶用） Tris 12.114g 双蒸水 100ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至100ml，高温灭菌后室温下保存。 30％Acr/Bic（29：1） Acr 29g Bic 1g 双蒸水 100ml 37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 20％Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后4℃保存。 （二）使用液 G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）（现在多用BCA定量试剂盒代替） 考马斯亮蓝G250： 100mg 95％乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml 高温灭菌后，室温保存。 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。 SDS凝胶电泳 10％分离胶和4％浓缩胶（一块胶） 10％分离胶（5ml） 5％浓缩胶（2ml） 双蒸水 1.9(ml) 1.4(ml) 30％Acrylamide（29：1） 1.7 0.33 1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 1.3 —— 1.0mol/L Tris·HCl（pH6.8） —— 0.25 10％SDS（十二烷基硫酸钠） 0.05 0.02 10%AP（过硫酸胺） 0.05 0.02 TEMED 0.002 0.002 注：加TEMED后，立即混匀即可灌胶。 还原型5XSDS上样缓冲液 5X SDSloading buffer 1XTris-HCL(pH6.8) 2.5ml SDS