WESTERNBLOTprotocal20140324..doc

蛋白质免疫印迹(Wsetern blot) 一、实验原理： Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。 首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。 二、实验操作： 1、操作总流程： 蛋白质提取及浓度测定——配胶——电泳——转膜——封闭——一抗孵育——二抗孵育——显色 2、抗体及试剂准备： 2.1 抗体准备： 目标蛋白 分子量大小 建议浓度 来源 Integrin α5 predicted band size:115kDa Observed band size:19,150kDa 1:1000-1:10000 Rabbit Integrin α9 predicted band size:140kDa Observed band size:114kDa 1:1000-1:10000 Rabbit Beta-actin 42 kDa 1:5000 Mouse 2.2试剂配制： 2.2.1 蛋白裂解液M-PER（Mammalian Protein Extration Reagent prod#78501 thermo pierce）8F 海尔，加入1:100-1:1000浓度（开始浓度常用1:200）的蛋白酶抑制剂Protease Inhibitor Cocktail Set III，EDTA-free（M calbiochem cat.No.539134）5F 细胞房-20℃冰箱。亦有人使用PMSF、RIPA buffer溶液裂解蛋白。 2.2.2 分离胶和浓缩胶的配方： 2.2.2.1 M Tris-HCl（pH6.8），用于分离胶的配制。8F小冰箱（成品）。 50ml：3g Tris-base加灭菌水约30ml，用盐酸缓缓调pH至6.8，定容至50ml，4℃保存。 2.2.2.2 M Tris-HCl（pH8.8），用于浓缩胶的配制。8F小冰箱（成品）。 50ml：9.08g Tris-base加灭菌水约40ml,用盐酸缓缓调pH至8.8，定容至50ml，4℃保存。 2.2.2.3 30% acrylamide（丙稀酰胺贮液，单体Acr-Bis，30% ）8F ，有成品，有毒！！！！ 8.76g acrylamide, 0.24g N, N-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml，滤纸过滤后4℃保存。 2.2.2.4 10%SDS 有，自己配制，粉末有毒！！！ 5g SDS+50 ml H2O，(难溶，可加热溶解)，常温保存。 2.2.2.5 10%APS （ammonium persulfate，过硫酸铵）自己配制，5楼黄色柜子,现配好的置于8F-20℃第二层，没有需要重新配制。有建议保存时间为1周。现在都是用很久之前钦策配制的-20℃的AP。 1g APS +10ml H2O，溶解后分装成100ul每管4°C保存。 2.2.2.6 分离胶： 溶液成分 不同体积凝胶液中各成分所需体积（ml） 5（一块胶） 10 15 20 25 30 6% ddH2O 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 30% acrylamide！ 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 1.5mol/lTris(PH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 10%过硫酸铵（APS）！ 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 TEMED！ 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 8%