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haoWestern blot protocol 步骤： 1. 分离胶和积层胶，制胶板； 注意：灌分离胶时不要加太多。 2. 蛋白变性：准备蛋白样本，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min） 3. 加样：每孔加入20～40μl样品 4. 电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA； 5. 取出胶板，用切割刀修好胶； 6. 将胶置于转膜液中浸泡； 7. 按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→NC膜→滤纸（用吸管赶去气泡）→海绵； 8. 置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液； 9. 装好电极，于恒定电压100V下，90min； 10. 丽春红染膜； 11. 用TBST洗去丽春红； 12. 封闭：加入5％脱脂奶粉＋TBST，常温摇床摇1h； 13. 回收封闭液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀释】； 14. 置于4℃摇床摇过夜； 15. 回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次； 16. 加入二抗【二抗用5％脱脂奶粉＋TBS稀释】，常温摇床摇1h； 17. 回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次； 18. 将膜置于发光液中浸泡约1min； 19. 将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。 常用溶液配制： Ⅰ 细胞裂解液（PLC Lysis Buffer） Final concentration 100ml 500ml 1M Hepes(pH7.5) 50mM 5ml 25ml 5M NaCl 150mM 3ml 15ml Glycerol 10% 10ml 50ml 50mM MgCl2 1.5mM 3ml 15ml Triton×100 1% 1ml 5ml 0.5M EDTA(pH8.0) 1mM 200μl 1ml 0.1M NaPPi 10mM 10ml 50ml 0.5M NaF 10Mm 2ml 10ml 每次提取蛋白前加入1％蛋白酶抑制剂 Ⅱ. SDS胶配方及其它常用溶液的配制 1．30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 29g N-N’-亚甲双丙烯酰胺 1g 溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃使其溶解，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。 注：（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。 （2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。 （3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。每隔数月应重新配制溶液。 2．3M Tris-HCl,pH8.8（用于分离胶） Tris碱分子量为121.1。将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH至8.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。加重蒸水定容至200ml，1.034×105 Pa，20min高压灭菌，RT贮存。 注：(1)如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris. (2)Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。 3．2M Tris-HCl,pH6.8（用于积层胶） 同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。 4．10%十二烷基硫酸钠（SDS） 在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。 注：SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。 5．TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。 6．10%过硫酸胺 过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。 方法：把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4℃保存数周。 7. 电泳缓冲液SDS buffer: 10X（running buffer） Tris base 30.3g Glycine 144.0g SDS 10.0g ddH2