X小体和PAS整理..doc

人类X小体的检测 一．实验原理 1. X小体的本质： 哺乳动物体细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体发生异固缩，功能上处于失活状态，将其称为X小体（X染色质，性染色质，巴氏小体 Barr body），通常位于间期细胞核的核膜边缘，染色深而致密 人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY和XX。女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。正常女性口腔黏膜上皮细胞中X小体阳性率10-30%。 2.X小体的数目：X小体的数目= X染色体数目－1 正常女性细胞：2条X染色体，X小体的数目为1 正常男性细胞：1条X染色体，X小体的数目为0 。 有三个X染色体者X小体的数目为2 3. 莱昂假说（Lyon hypothesis ） （1）正常雌性哺乳动物体细胞中的两个X染色体之一在遗传性状表达上是失活的。 （2）X染色体的失活是随机但恒定的。失活的X染色体可来源于雌性亲本，也可来源于雄性亲本。 （3）失活现象发生在胚胎发育的早期，一旦出现则从这一细胞分裂增殖而成的体细胞克隆中失活的都是同一来源的染色体 4. 剂量补偿（dosage compensation effect） 女性有两条X染色体，但所表达的绝大部分遗传物质与只有1个X染色体的男性是一样多的。这种男女X连锁基因产物相等的现象在遗传学上称为剂量补偿。 5. X小体的应用 （1） 鉴定个体的性别 胎儿细胞性染色体检查：羊水细胞，绒毛细胞，用于预防性染色体遗传性疾病的发生，优生。 （2） 诊断性染色体异常综合征 克氏（Klinefelter’s）综合征，先天性睾丸发育不全综合征，患者为男性但有一 个巴氏小体，核型是47，XXY 。 特纳氏（Turner’s）综合征，先天性卵巢发育不全综合征，患者为女性但却无巴氏小体，核型是45，XO 。 超雌：XXX, XXXY有2个巴氏小体等。 二．实验材料 取材：女性口腔粘膜上皮细胞 试剂：0.85%生理盐水，低渗液0.075M KCl，Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l，现配）， 5M 盐酸，0.2%甲苯胺兰染液 耗材：牙签、离心管、载玻片、染色缸 仪器：恒温水浴箱，离心机，光学显微镜 三．实验方法 1.取材：吸取5ml生理盐水于离心管中，漱口后用牙签钝端从口腔两侧颊部刮取女性口腔粘膜上皮细胞4-5次，置入离心管的生理盐水中洗脱下来，轻轻摇匀，1000r/min离心10min，弃上清。 2.低渗：加入5ml预热的低渗液，轻轻混匀，37℃低渗10min。 （低渗液的作用：低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态） 3.固定： （1）加入新鲜配制的Carnoy固定液1ml，混匀，室温预固定2min，1000r/min离心8min，弃上清 （2）加入固定液5ml，吹打混匀，室温固定15min，1000r/min离心10min，弃上清。 （3）加入固定液0.5-1ml，混匀，制成细胞悬液。 （固定液的作用：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，使蛋白凝固，终止细胞代谢过程，并保持细胞核染色体结构的完整性，并且能够增强染色体的嗜碱性，达到优良的染色效果。） 4.滴片：吸取细胞悬液自10—20cm高垂直向下滴在一张预冷的载玻片上（2-3滴），标记，空气风干或烘干。 （目的：从高处向下滴片，让液体分散开：形成细胞单层，使染色体分散，便于 观察。用冰片：是降低液体的表面张力。） 5.水解：玻片放入盐酸缸中，室温水解10min后取出，自来水细水漂洗数秒钟，洗去多余盐酸，空气风干或烘干。 （水解可除去细胞间的果胶质，使细胞壁软化或部分分解，从而使细胞和染色体易于分散，同时可去除杂质。） 6.染色：玻片放入甲苯胺兰染液缸中，染色3min后取出，自来水细水漂洗数秒钟，空气风干或烘干。 （甲苯胺兰是一种碱性染料，与细胞核蛋白（酸性）结合，染成紫蓝） 7.镜检：低倍镜→高倍镜。 四．注意事项 1.取材前需用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用洁净的牙签钝端从口腔两侧颊部刮取粘膜，为防止后面的离心损耗，应尽量多取一些。 2.弃上清时，用吸管吸取上清，弃去，接近下方沉淀时，应小心吸取。 3.加入低渗液后，轻轻混匀，不能太用力，以防核膜破裂。 4.固定液使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果。 5.载玻片于临用前在-20度冰箱中取出，现用现取，以防温度上升。 6.加热时应距离外焰一段距离（2-3cm），且来回摆动，以防过热引起断裂。 五．实验结果 1.实验结果的观察： 低倍镜：选择轮