“酶”处理染色质免疫沉淀（琼脂糖微球式）..doc

“酶”处理染色质免疫沉淀（琼脂糖微球式）操作方法 试剂： 甘氨酸溶液（10X） （4X） （4X） ChIP（10X） ChIP（2X） 5 M NaCl 0.5 M EDTA 1M DTT DNA漂洗（缓冲）液 DNA洗脱（缓冲）液 DNA纯化柱 蛋白酶混合抑制剂（200X） （10 mg/ml） 微球菌核酸酶（2000 gel units/μl）NEB #M0247S 蛋白酶K（20 mg/ml）NEB #P8102S 人对照基因RPL30外显子3引物 小鼠对照基因RPL30内含子2引物 组蛋白H3（D2B12）XP?（ChIP） #4620 #2729 ChIP级蛋白G琼脂糖微球 #9007 不包含的试剂： PMSF （0.1 M） 乙醇（96-100%） 1X PBS 无核酸酶的水 Taq DNA聚合酶 dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）混合液 体内交联，细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质 开始之前： 每次实验需要刺激或处理大约4X 107个细胞。这些细胞中提取的染色质可以用于多达10次单独的免疫沉淀实验。 以Hela细胞为例，这相当于5个15 cm培养皿中细胞密度达到90%时的总细胞数（一般每个盘中的培养基为20 ml）。 另外准备一盘细胞用于血球计数板法测定细胞数。 取出并需预热的试剂： 200X蛋白酶混合抑制剂 1 M的二硫苏糖醇 0.1 M PMSF （） 10X ChIP 为每4 X 107细胞准备以下试剂，并在冰上预冷（5个培养皿）： 10 ml 10X 甘氨酸溶液 200 ml 1X PBS（自备） 10 ml 1X PBS + 100 μl PMSF 10 ml 1X 缓冲液 A （2.5 ml 4X缓冲液 A + 7.5 ml 水） + 5 μl 1 M DTT + 50 μl 200X l （PIC） + 100 μl PMSF 11 ml 1X 缓冲液 B （2.75 ml 4X 缓冲液 B + 8.25 ml 水） + 5.5 μl 1 M DTT 1 ml 1X ChIP 缓冲液 （100 μl 10X ChIP 缓冲液 + 900 μl 水） + 5 μl 200X 蛋白酶混合抑制剂 （PIC） + 10 μl PMSF 为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 ml培养基的15cm培养皿中加入540 μl 37%的甲醛溶液。稍加转动培养皿使之混匀，室温放置10分钟。 甲醛的终浓度为 1%. 使用新鲜未过产品保质期的甲醛溶液 加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变。 每个盘中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟。 加入甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。 对于贴壁细胞，弃去培养基后用冰冷的PBS漂洗两次（20 ml /次），彻底弃净PBS。对于悬浮细胞，4℃ 1500rpm离心5分钟，沉淀用冰冷的PBS漂洗两次。 每盘细胞中加入2 ml冰冷的1X PBS + PMSF，将细胞刮下并将5盘细胞收集到一个15 ml的锥底管中。悬浮细胞直接将细胞重悬到2 ml的冰冷缓冲液中合并即可。 4°C 1500rpm离心5分钟。弃上清，并将细胞重悬在10 ml冰冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF 4°C 3000rpm离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清，并将沉淀重悬在10 ml冰冷的缓冲液B + DTT1.0 ml 缓冲液 B + DTT 加入5 μl微球菌核酸酶°C孵育20 min，每隔3~5分钟颠倒混匀一次，将DNA消化成长度约为150-900 bp的片段。 需要做预实验确定将不同细胞系DNA酶切到理想长度所需微球菌核酸酶 4 X 107个HeLa细胞核用5 μl微球菌核酸酶缓冲液 B + DTT 加入100 μl 0.5 M EDTA终止消化，将离心管置于冰上。 4°C 13000rpm离心1分钟，沉淀细胞核。弃上清。 将细胞核沉淀重悬在1 ml 1X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF 对每管细胞核样品用超声波处理数次以破碎核膜。在每次超声处理操作之间，将样品在冰上孵育30秒。 可以在超声前后利用光学显微镜观察细胞核以判断完全破碎细胞核所需的最佳条件。 利用VirTis Virsonic 100超声破碎仪，设置模式6，1/8英寸的探头，对Hela细胞核进行每次20秒，共3次的超声处理可以达到完全破碎的效果。 或者也可以用杜恩斯 4°C 10000rpm离心10分钟，使样品澄清。 将上清转移到一个新管子中，即为交联的染色质样品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 μl用以分析DNA的酶切情况并确定其浓度（） B. 分析染色质的浓度和酶切情况（推荐步骤） 向50 μl的染色质样品中（13步）μl无核酸酶