生物化学与新生物技术.ppt

第十五章??生物化学与新生物技术 几个代表物种的基因组大小 基因组学genomics 发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，研究生命体（包括人类）全部基因组结构及功能的学科 基因组学研究的最终目标 获得生物体全部基因组序列 鉴定所有基因的功能 明确基因之间的相互作用关系 阐明基因组的进化规律 人类基因组计划HGP 遗传标记 物理图 策略 用机器进行自动测序，一次可读400－800个碱基，由于测定的序列长度有一定限制。 克隆重叠群法 鸟枪法 克隆重叠群法 将基因组DNA切割长度为0.1Mb－1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列 再装配、连接成连续的DNA分子。 这是一种自上而下（up to down）的测序策略 clone-by-clone method 鸟枪法 将较长的基因片段打断，构建一系列的随机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的DNA定序。 测序技术 Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert化学修饰法 高通量测序技术 功能基因组学 转录组学基本研究方法 生物芯片 在载体材料上，以大规模阵列的形式排布了不同的蛋白质或核酸等生物分子，形成可与目的靶分子相互作用，并进行反应的固相表面。 DNA芯片 通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的DNA检测 基因组芯片 表达芯片 芯片载体 玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶、金属 对载体进行化学修饰，活化试剂通过化学反应在载体表面键合上活性基团，以便与配基结合，形成具有生物活性的亲和表面，用于固定蛋白质和核酸 活化试剂：EDC、NHS 活性基团：氨基、环氧化物、巯基、醛基 原位合成 激光照排技术 基因芯片的应用 基因表达谱分析 基因发现 SNP检测 药物基因组学 微生物菌种鉴定 预防医学研究 RNA-Seq 转录组测序（全转录组鸟枪法测序）：利用深度测序技术对各种类型的转录本进行高通量检测，获得RNA片段在特定样本中的含量 定量化 可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题 灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本 可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本 蛋白质组学 蛋白质组：一个细胞（或组织、机体）所表达的全部蛋白质 蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学 本质是在大规模水平上研究蛋白质特征： 表达水平 （量） 翻译后的修饰（成熟与调控） 蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等 由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识 蛋白质组学研究范畴 蛋白质和蛋白质间相互作用 蛋白质和核酸之间相互作用 蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定 蛋白质结构分析 生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异 蛋白质信息库 研究策略与技术 两条互补的实验流程 基于凝胶的工作流程 基于液相色谱的工作流程 双向电泳（2D） 是等电聚焦电泳和SDS的组合 即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离） 然后再进行SDS（按照分子大小） 凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图 第一向IPG-IEF电泳 固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing） IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术 将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带 第二向垂直SDS电泳 2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 染色： 1）考马斯亮兰染色法； 2）银染法； 3）负染法； 4）荧光染色法； 5）放射性同位素标记法等 2-DE 凝胶蛋白质斑点的分析 图像扫描和分析 全自动斑点切取系统 2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 质谱 使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散，使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其分子量 MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸