l氨基酸自动分析仪简介.docVIP

氨 基 酸 自 动 分 析 仪 氨基酸是蛋白质的组成成分，是蛋白质化学研究的主要内容之一。蛋白质是一切生命物质的基础，因此，探讨和揭示生命现象的发生、生长、新陈代谢、遗传变异过程，都与氨基酸的研究有关。 随着近代物理学、化学和电子学的飞速发展，氨基酸的分析技术亦在不断更新。氨基酸分析仪是本世纪50年代研制的，仅40多年，已发展到现在的进样、分离、检测和数据处理全部自动化的程度。检出量由微克分子到毫微克分子，分析时间由原来的24小时到现在的半个小时，分析技术的提高促进了其他科学领域的发展。 氨基酸自动分析仪的进展 用于氨基酸分析的方法很多，有纸色谱法、柱色谱法、薄层色谱法、电泳法及气相色谱法等。一般认为离子交换柱色谱法是较为精确的检测方法，氨基酸分析仪就是在此基础上研制成功的。1951年Moor和Stein采用离子交换树脂色谱，用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计，后来在Spaekman的协助下，使分析操作自动化。迄今氨基酸分析仪的条件和自动程度有了很大的改观，其特点主要表现以下几个方面。 ⒈树脂粒径减小 近年来制成的小颗粒球状树脂，使氨基酸分析仪得到很大改进。由于树脂粒径减小就对应地增加等量树脂的总面积，使现在少量树脂达到过去大量树脂的分离效果，从而减小了树脂柱的内径和体积，节省了试剂用量，缩短了分析时间。树脂的粒径从200→20→10→5μm。 ⒉色谱柱内径缩小 树脂粒径减小使填充树脂床的色谱柱内径减小，由过去的粗长柱变为微柱。色谱柱内径的变化为18→6→2.8→1.75mm。 ⒊输压泵压力增高 一般氨基酸分析仪采用低压泵，其施加于输液的压力只有几9.80665×104Pa，以后增加至几十9.80665×104Pa，现在发展到2068×104Pa。 ⒋分析时间缩短 由于树脂粒径的改善，色谱柱内径缩小和泵压增高，使分析时间大大缩短。蛋白质水解液的分析时间从过去的24小时缩短到现在的半个小时左右。 ⒌仪器灵敏度提高 由于仪器的不断改进，使灵敏度大为提高，过去仪器的最高灵敏度已远不及现在仪器的最低灵敏度。现在一般氨基酸分析仪的灵敏度均达到0.1nmol。 ⒍试剂用量减少 由于分析时间大大缩短，致使试剂消耗量大为降低。氨基酸分析的试剂要求纯度很高，且价格昂贵，试剂用量减少会降低分析费用，试剂流量(每小时茚三酮试剂的用量)的变化为70→35→18→3.5ml。 ⒎样品用量少 由于仪器灵敏度不断提高，同时不少仪器采用单柱分析法，所以样品用量逐渐减少，从过去一次分析需要样品几ml到现在只用20μl。这对科研中难以收集和制备的样品以及许多生物样品的微量分析提供了十分有利的条件。 ⒏自动化程度提高 由于采用多样品自动注入器、程序控制和数据处理系统，使仪器从进样到每个氨基酸结果打印的全过程都自动化。并且当仪器出现故障时又能自动停机，因此可以自动地进行工作。 ⒐显色试剂和检测器的改善 显色试剂中除了茚三酮仍被广泛应用外，荧光试剂受到人们的重视。以前认为很有发展前途的荧光胺已被邻苯二甲醛所取代。目前用邻苯二甲醛的荧光计检测器检测的灵敏度比用茚三酮显色后经分光光度计检测的灵敏度高100倍以上。 氨基酸分析原理 ⒈氨基酸的理化特性 氨基酸是无色的结晶物质，氨基酸分子()至少有一个氨基和一个羧基，在水溶液中呈中性、弱酸性或弱碱性，是两性电解质，它所带的电荷随介质pH而变化。当氨基酸处于H+介质中，羧基的解离作用被抑制，整个分子获得一个质子带正电荷；反之，当它处于OH-介质中，则从氨基夺走一个质子，从而整个分子带负电荷。当处于某一pH下，两性离子所带正负电荷数相等时，此时的pH值就是该氨基酸的等电点，整个分子呈电中性。一般氨基酸都能溶于水和其他极性溶剂，而难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。 由于氨基酸结构不同，等电点亦有差异。氨基酸等电点是取决于其羧基和氨基的解离常数的相对值。由于羧基的解离常数大于氨基酸的解离常数，故一般氨基酸的等电点为弱酸性。 由于氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它们都能产生氨基和羧基的一般化学反应，如酯化、甲基化、乙酰化以及酸碱中和反应等。这里仅就氨基酸分析仪采用的与茚三酮试剂显色反应加以描述。 氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解为CO2、NH3和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。在弱酸性溶液中(pH=5)，还原茚三酮与NH3及另一个分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物茚二酮炔―茚二酮胺(DYDA)。反应式为： 由于DYDA在570nm处有最大吸收峰，所以广泛地用于氨基酸比色测定。唯脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440nm处有较强的吸收峰。 ⒉离子交换树脂 离子交换色谱是以液体作为流动相