构建啤酒酵母菌工程菌..docx

Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072工程化啤酒酵母细胞利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇Z. Rao, Z. Ma, W. Shen, H. Fang, J. Zhuge and X. WangThe Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, Research Center of Industrial Microbiology, School of Biotechnology andState Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu Province, P.R. China摘要目的：在发酵产业中啤酒酵母是一种安全的微生物。1,3-丙二醇是一种广泛用于聚合物生产的重要化学原料，但是由于化学合成成本昂贵，它的实用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生产1,3-丙二醇。方法与结果：啤酒酵母利用D-葡萄糖作为原料，能够生产丙三醇，而不是1.3-丙二醇。在本研究中，我们克隆了两个基因yqhD和dahB，这两个基因可以使丙三醇转化成1,3-丙二醇，把这两个基因通过农杆菌转化实验整合到啤酒酵母的W303-1A染色体上。这个工程化的啤酒酵母通过功能性yqhD和dhaB基因来实现D-葡萄糖到1,3-丙二醇的生产。结论：啤酒酵母可以被工程化来利用廉价D-葡萄糖原料生产1,3-丙二醇。意义与研究影响：据我们了解，本研究首次利用农杆菌介导的转化来使啤酒酵母生产1,3-丙二醇。该研究可能在1,3-丙二醇生产产业中是一种安全的、低成本的方法。关键词：农杆菌介导法，dhaB基因，丙三醇，1,3-丙二醇，啤酒酵母，yqhD基因前言1,3-丙二醇广泛用于聚合物、化妆品、食品和医药行业，但是由于它的高成本受，应用受到限制。举例来说，1,3-丙二醇最成功的一个应用就是合成聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT），这种材料广泛用于地毯和纺织纤维的制造。作为一种好的聚合物，PTT正广泛扩大它的产业应用，但由于高成本和1,3-丙二醇低实用性的原因而受到限制。1,3-丙二醇主要是通过高成本的化学合成来生产。目前急需一种新的低成本的方法来生产1,3-丙二醇。相比较化学合成，发酵方法有低成本的优势，而且已经广泛用于多种化学行业。理想的发酵生产需要一种能利用可再生资源生产所需化学原料的安全微生物。在自然界中，一些微生物，包括克雷伯氏菌属（Huang et al.2002）,柠檬酸菌属（Boenigk et al. 1993）和梭菌属（Saint-amans et al.2001）都能生产1,3-丙二醇，但他们都使用昂贵的丙三醇作为原料。在克雷伯肺炎菌中，参与1,3-丙二醇的生物合成的基因是dhaB和dhaT（Fig.1b）DhaB是一种依赖维生素B12的脱水酶，它转化丙三醇到3-羟基丙醛，而DhaT是一种依赖NADH的氧化还原酶，它可以转化3-羟基丙醛到1,3-丙二醇（Skraly et al.1998）。像大肠杆菌，它能利用D-葡萄糖生产丙三醇，可以通过把dhaB和dhaT基因整合到大肠杆菌来生产1,3-丙二醇，但是收率太低（Laffend et al.1997）。已经证实收率低的原因是DhaT活性过低，导致3-羟基丙醛在细胞中堆积。当浓度到达30mmol/l,DhaB的活性就会由于反馈抑制而降低(Barbirato et al.1996)。在2002年，Emptage等人报道了yqhD基因，一种在大肠杆菌的酒精脱氢酶，有很高的DhaT活性。通过在大肠杆菌中过表达基因dhaB和yqhD，利用YqhD高的活性生产1,3-丙二醇已经被证实(Zhang et al. 2005; Wang et al. 2007)。啤酒酵母已经用于发酵产业好多年了，主要是由于它使用D-葡萄糖这种低成本原料作为碳源和能源。更进一步，由于大肠杆菌产生内毒素，可能引起疾病，所以啤酒酵母被认为比大肠杆菌更安全。啤酒酵母真的能用来生产1.3-丙二醇吗？这是导致本次研究的问题。野生型啤酒酵母只产生丙三醇，但没有产生1,3-丙二醇的能力（Fig.1a）。在本研究中，我们通过农杆菌介导的转化法把dhaB和yqhD基因整合到啤酒酵母的染色体上，构建一个新的W303-1A-ZR菌株。工程化的啤酒酵母可以利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇（Fig.1c）。该研究可能是一种安全的、有效益的方法来实现1,3-丙二醇的产业化生产。图一：工程酿酒酵母利用1,3 -丙二醇形成规模化的生物合成途径。(一)野生型s .酵母W303-1A只能从葡萄糖合成甘油。(b