植物细胞工程材料..doc

第八章 植物基因转化受体系统 有多种途径将外源基因导入植物细胞，概括起来分为3类: ① 生物介导，如农杆菌等介导的基因转移；② 物理方法，以基因枪法为代表； ③ 化学方法，以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)为主。 根据Hemmer (1998)对28种转基因产品的统计，通过农杆菌介导的基因转化占64%，基因枪法占24%，PEG和电击法占7%，其他方法为5%。 1. 农杆菌介导的植物遗传转化技术 高等植物中农杆菌介导的遗传转化需具备以下几个条件： a. 植物外植体必需能够产生乙酰丁香酮(acetosyringone, 3’,5’-二甲氧基-4’-羟基乙酰苯)或其他相关化合物来激活vir基因，或用合成的乙酰丁香酮对农杆菌进行预诱导； b. 诱导的农杆菌应该能够进入处于适宜转化状态的植物细胞 c. 转化的细胞或组织应该能够再生成完整植株。 农杆菌转化的三种方法 a.整株感染法 此法是模仿根癌农杆菌天然的感染过程，用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的方法； 具体做法是：人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。为了获得较高的转化频率，一般多采用无菌种子的实生苗或试管苗；诱导形成的瘤被切下作为愈伤组织培养，最后将转化的愈伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导再生植株。 b.叶盘转化法 叶盘转化法(leaf dish transformation)是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起来的一种转化方法。 在实践中，这种方法可以用于任何具备再生系统的外植体；其步骤是用打孔器取得圆叶片(叶盘)，在农杆菌菌液中浸渍数分钟，然后在固体培养基上共培养2~3天；接着，将外植体转移到含有抑菌剂和选择剂的培养基上，除菌和使转化细胞生长并再生植株；叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、萌发的种子均可采用类似的方法进行转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前应用最为广泛的方法。 c.原生质体共培养转化法 原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株；与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体；应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植株技术体系。 农杆菌转化的步骤 农杆菌的活化：将含有目的基因的农杆菌培养在含有合适抗生素的固体选择培养基上，挑取平板上的单克隆，接种于5~10 ml含有抗生素的液体培养基上；如果要用乙酰丁香酮对农杆菌进行预诱导(如转化单子叶植物)，那么在液体培养基中应该加入乙酰丁香酮；于28 ℃下暗培养2 d后，取适量农杆菌菌液，不稀释或稀释数倍，用于浸染； 浸染及共培养：将经过预培养或未经预培养的外植体在菌液中浸染数分数，然后用无菌纸吸干外植体表面的菌液，并转移到不含抑菌剂的培养基上共培养2~3天(这一步使农杆菌生长、快繁并进行T-DNA转移)。 愈伤组织(不定芽)的诱导：将外植体用无菌蒸馏水洗几遍或直接转移到含有抑菌剂(如头孢霉素或羧苄青霉素)的培养基上以杀死农杆菌，同时诱导愈伤组织或直接诱导不定芽(大约每隔20天继代一次)。 转基因植株再生：在继代1~2月后，抗性愈伤组织分化出苗或从外植体上直接诱导分化出不定芽，将它们切下在生根培养基上诱导生根，形成完整植株，这些植株即为初选的转基因植株。 转基因植株的检测：进一步通过PCR和Southern blot检测再生植株中外源基因的表达，确定真正的转基因植株；通过其他方法进一步检测外源基因的表达。 2. 植物基因转化受体系统 植物基因转化受体系统：一般是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统；一个成功的受体系统必须具有较强地接受外源基因的能力、能够高效再生植株、并能将外源基因稳定地遗传给后代。 2.1 植物基因转化受体系统的条件 a. 高效稳定的再生能力 ?用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的实验稳定性和重复性；从理论上讲，植物的任何细胞都具有再生完整植株的潜能，但培养的实践证明，并不是所有的体细胞都能再生出完整植株。 b. 较高的遗传稳定性 植物基因转化是有目的地将外源基因导入植物并使其整合、表达和遗传，从而达到修饰植物原有的遗传物质、改 造不良农艺性状的目的；这就要求植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传体系，同时又