膜片钳实验与技术讲述.ppt

激光共聚焦与膜片钳相结合方法 重组DNA克隆与膜片钳相结合法 全细胞电流记录 　　全细胞记录是膜片钳四种基本模式之一。尽管它记录的是细胞膜多个离子通道开放产生的宏膜电流，但由于该模式既可以对离子通道的性质和分类进行宏观性质的分析，也可以对离子通道的构造、分布与功能进行微观性质的分析，从而使其成为当前电生理研究中应用最广泛的一种模式。 　　全细胞记录模式可用于测定在某个时间和电压情况下，离子通道电流的大小，观察其电压依赖性特征，如以膜电位为横座标，电流强度为纵座标，则可绘制出电流-电压关系曲线（I-V曲线）。在电流为零时的膜电位被称为反转电位。 I-V曲线和反转电位反映了某种通道的电压依赖性及药物等因素对通道电压依赖性的影响，常作为全细胞记录模式结果分析的指标之一。 　　  　 钠通道的激活是电压门控的，当细胞膜去极化至-60mV左右时，即可引起膜上大量钠通道激活，产生一迅速激活并迅速失活的内向电流，当去极化至-30 mV左右时达到最大，反转电位为+30 mV左右。在参数设计上应使保持电位钳制在-80 mV以下，此时给予不同程度的去极化阶跃电压，则可得到钠电流，由于钠通道激活和失活均很快，因此刺激脉冲波宽常为20~50 ms。 钠通道电流的测定 　 为证实所测电流为钠电流，常借助于工具药，如河豚素（TTX）用于细胞外液中，可以选择性阻断钠通道。由于神经与心脏中的钠通道亚型不同。心肌钠通道对TTX的敏感度比神经低数百倍。　　 当膜电位钳制在-80 mV，去极化中还可能引起某些钾通道成分的激活，此时可使用钾通道阻断剂或将电极液中KC1以CsC1取代可起到抑制钾通道激活的作用。 钙通道电流的测定 （1）L型钙通道: 膜电位钳制在-60 mV，这样即较大程度的激活了L型钙通道，又有效的抑制了钠通道；激活与失活时间较长，因此去极化脉冲的保持时间在200~500 ms之间；L型钙通道的最大电流约在0~+10 mV；反转电位为+40~+50 mV左右。 L型钙通道除对二氢吡啶、Verapamil以及硫氮卓酮等钙拮抗剂敏感外，对某些无机离子如Cd2+也很敏感，20μM Cd2+就可使钙通道活性抑制90%以上，常被用作全细胞膜片钳实验中的工具药。 　　值得注意的是，L型钙通道电流测定时,可随时间产生衰减,即所谓run-down现象。尽管许多学者进行了大量的研究，但仍不能有效地防止这一现象，严重时在10分钟之内就可使钙电流减少30~50%。如不加以矫正，则直接影响结果的可靠性，尤其是给药前后的对比，因此在实验设计中，必须考虑到这一因素，并设立严格的对照组。 （2）T型钙通道: ①激活所需的膜电位较低,通常为-100~-60 mV。此差别常用来与L型钙通道进行鉴别，如将膜电位钳制在-40 mV时，去极化只能得到L型钙电流，因T型通道已被完全抑制。 ②当有钠通道和钾通道拮抗剂存在时，膜电位被钳制在-100 mV时，进行不同程度的去极化，所得到的内向电流可分为两种成分，即快速失活的T型钙通道电流和缓慢失活的L型钙通道电流。 ③T型钙通道对双氢吡啶类钙拮抗剂均不敏感，Cd2+对其抑制也不明显。 （3）N型钙通道则仅存在于神经细胞和突触部位，这种通道激活时，所需的膜电位与T型钙通道相似，范围在-100~- 40mV。此型电流不能被二氢吡啶类钙拮抗剂所抑制，但可被较低浓度的Cd2+所阻断。ω-CTX是其具有相对特异性的拮抗剂。 钾通道电流的测定 　　钾通道是亚型最多、分布最广的一大类离子通道，现在已知并具有明确功能及动力学特性的钾通道就有十多种，各种钾通道亚型的特征电流不如钠或钙通道电流明显，因此在研究中要根据它们的电压及时间依赖性，选择恰当的刺激步骤及时间，配合特定工具药进行区分。 （1）内向整流钾电流（IK1），主要参与细胞膜静息电位的形成，并直接影响动作电位的形态。通常保持电位-60mV，阶跃电压从超极化（-120mV）至去极化（+30mV），将各钳制电压末期的电流对膜电位作图，得出电流-电压关系曲线（I-V曲线），其形状为“N”型，反转电位为-70~-60mV，主要受细胞外钾的影响。该电流受到抑制时，可使膜电位升高，动作电位延长，尤其是终末相斜率变大。 （2）延迟整流钾通道电流（IK）是在去极化过程中被缓慢激活的一种外向电流，测定这类钾通道时，去极化时间应保持足够长，有时需1~2秒。根据对E-4031不同的敏感性，IK主要含有两个电流成分，即快速激活电流成分Ikr和慢激活成分IKS，该电流属于无失活电流。现有的Ⅲ类抗心律失常药均选择性作用于IKr，筛选有关抑制IKS的Ⅲ类抗心律失常药物具有重要的理论和实际意义。 （3）瞬时外向钾通道（I