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PCR技术及其应用实例和前景 检验0905郭媛媛 PCR是我们研究 分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。 摘要：PCR (ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。 关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大1 引言 人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。 20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测Environment Supervise)分子克隆Member Clone)、序列分析Alignment Analysis)、考古研究Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，这就是我要介绍的PCR技术。2 PCR技术原理 下面我通过摘录了一个实验[2]，来介绍一下PCR技术的过程及其原理(至于它详细的实验过程和方法详见参考文献)。. 在94°C高温下双链变性，分离出DNA单链的模板，然后降温55°C)，然添加的与DNA单链配对，紧接着温度升高72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸开始渗入，并从引物的结合端开始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互补链，这一过程称为一循环，然后重复该循环，模板DNA被大量复制。 在此，我要特别强调几点注意事项，这也是这个实验设计者提醒我们需要注意的地方： 1) 在配置PCR反映体系的过程中，Taq酶应在加入dNTP混合物后加入，因为有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反应较强，反映体系如果不含dNTP，反应体系中的引物可能被分解。 2) 非特异性扩增产物，可能是模板有与引物同源性高的其他位点，其次是复性温度太低，适当提高复性温度就可以解决这些问题。 以上实验可清楚明了地向我们展示PCR技术的原理。 3 PCR技术分类 PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历了20年的飞速发展，是传统微生物学与现代基因学之间的完美结晶，已成为当今世界上不可或缺的一项重要的微生物应用技术，下面我将介绍几种常用的PCR技术[3] 3.1反转录PCR 反转录PCRreverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子为模板的扩增技术，主要用于克隆cDNA、检测RNA病毒、合成cDNA探针机构建RNA高效转录系统。 3.2定量PCR 定量PCRquantitative PCR)的基本原理是。假定其反应产物的数量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通过琼脂糖电泳样品条带得比较，便可以确定两种PCR产物之间的数量关系。另外定量PCR还有广义和狭义之分[4]，在此就不详细介绍了。 3.3实时荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用映光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 3.4重组PCR 重组PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上进行点突变，即扩增产物中含有域模板序列不同