动物细胞培养技术..doc

动物细胞培养技术 细胞培养在肿瘤学研究上的作用（例如化疗中的药物使用剂量、癌症研究等） 细胞培养在细胞功能与分化研究中的应用； 细胞培养在免疫学中的应用 1)Harrison首先解剖出蛙胚原始脊髓节段进行培养。 哈里森悬滴培养法。建立起一套合理的无菌操作技术。（淋巴） 一般皆公认Harrison为“组织培养之父”，凹玻片悬滴制备培养技术，对生物学知识的研究做出十分重要贡献。 2) Carrel 反复传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶，Carrel flask)等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。 30年代传入我国，50年代逐渐发展 细 胞 培 养 设 施和 基 本 条 件 （一）细胞实验室 基本原则： 防止微生物污染和有害物的影响。和其它微生物培养不能在同一区域进行。 净化工作室 细胞培养实验室区域设置 一般分三区：无菌室、缓冲间、准备室 一、准备室的主要作用 消毒和培养物质的准备以及供应物品的保藏等。 准备室内应有的设备： 水槽和盛物台、酸缸、水盆和桶、电炉和锅、物品准备台和水纯化装置、高压蒸汽消毒器、电热干燥消毒箱、储柜或储架。 二、缓冲室 1）减少外界污染源带入培养室 2）应有消毒水、无菌衣和紫外灯或臭氧机 三、无菌室（操作室或培养室 无菌室要求 1）培养室要密闭、无外窗 2）空气调节机要用中央风机 3）培养室的墙壁最好贴瓷片，墙壁要光滑无死角，地面可用水磨石或瓷砖 4）装有紫外灯，天花板不宜高过2.5米 无菌室应放置的设备： 超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、真空泵或气泵、冰箱、杂物柜、小型低速离心机 。 （二）超净工作台 原理：鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，通过工作台面，形成无菌环境。 按气流方向可分为外流式和侧流式： ①外流式：净化的气流朝操作者方向流动。 ②侧流式：气流从上向下或从左至右流向对侧。 使用注意事项： 每三个月清洗一次粗滤网； 根据情况更换除菌滤网； 二、常用的大型必备装置和仪器 1.培养箱：二氧化碳培养箱，CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意： ① 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ② 保持培养箱内空气干净，定期消毒。 ③ 箱内灭菌蒸馏水，也可加入防腐剂以保持箱内湿度，避免培养液蒸发 2.倒置显微镜： 了解细胞生长情况，及时发现污染和污染类型。 注意事项: 在照明期间,注意不要触及灯泡和集光镜，不要将易燃物质靠近灯泡； 随时关闭电源 3、冷冻保存装置 细胞培养中常需储存细胞，常用的是液氮容器。 液氮罐为双层结构，中间为真空层。内胆颈部与体部经焊接相连。 总的来说，可分为窄颈瓶和宽颈瓶。 使用时应注意事项： 1、搬动和装入液氮时，要小心缓慢加入； 2、由于液氮不断挥发，经注意观察存留液氮情况，及时定期补充，防止挥发过多而致细胞受损。 4.冰箱 -20 ℃ 。 粉状培养基、消化酶、谷氨酰胺要贮存在4℃； 血清、配制的抗生素、谷氨酰胺溶液等，需长期冷冻。 如有条件，可配置-80 ℃冰箱 5.水纯化装置 (1)自动双重纯水蒸馏器： (2)自动纯水仪 双蒸器使用应注意事项： 1、使用时先开启冷却水水源。 2、要调节去离子水或蒸馏水流速，使之进入一次横式烧瓶的速度基本上与二次横式烧瓶的流出速度相等。 3、停用时应先关闭去离子水，再关闭电源，最后关闭冷却水。 4、不可用普通自来水蒸馏。 5、不宜使用存放数日的三蒸水。 新购回的蒸馏器清洗方法： 1.自来水冲洗； 2.在1％稀盐酸中浸泡24h，再用自来水冲洗； 3.用单蒸水涮洗数次； 4.安装好后，开始10min内蒸馏出来的水，舍去不用。 蒸馏器清洗步骤： 1、移下冷却管，小心加入约100ml浓盐酸到横式烧瓶内； 2、半小时后，放出盐酸，自来水冲洗数次，去离子水冲洗后备用。 6.离心机 一般1000rpm就可使细胞沉降，速度过大易使细胞损伤，实验室配置4000rpm国产离心机即可。 7.pH计（酸度计） 培养用的许多溶液要求pH值(7.2～7.4) 8.天平 一般用电子天平配制溶液。 一般组织培养需配置一台小型的普通天平 9.高压蒸汽消毒装置： 1）大容量高压灭菌器 2）全自动手提式灭菌器 用于培养的培养器皿、三蒸水、一些培养用液、手术器材、胶塞等均需高压蒸汽灭菌。 对于手术器械、培养器皿等物品在灭菌后要迅速使之干燥。 10.电热干燥箱 温度范围在50～300℃;主要用于器皿的干燥及干热消毒。 干热消毒（160℃ ，2小时）,主要用于玻璃器皿消毒 磁力搅拌器 二、最常用的培养器具 1.过滤除菌装置： 微孔滤膜滤器：滤膜的材料为混合纤维素酯，孔径有数种，常用有0.22微米和