基因工程笔记总结..doc

第二章 Enzymes 第四节 DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、ATP（NAD+)提供激活的AMP。 2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP与连接酶的赖氨酸?-氨基相连。 4、AMP随后从连接酶的赖氨酸?-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、 3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种 DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端 及 平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端；2. 平末端；3. 平末端加尾；4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端? 3. 平末端连接同聚物加尾法 （1）末端脱氧核苷酸转移酶功能：5’至 3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。 缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’ -末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 第五节 DNA聚合酶DNA Polymerase 常用的DNA聚合酶： 1、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ 2、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶 3、T4 DNA聚合酶 4、T7 DNA聚合酶 5、反转录酶等。 一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ特点 活性： 5’ 3’聚合 低 5’ 3’外切 有 3’ 5’外切 低 DNA聚合酶Ⅰ的应用——放射性探针的标记 (1)DNA聚合酶Ⅰ的两种特殊反应： 切口转移与链取代 (2) 切口转移法制备放射性DNA分子杂交探针 二、Klenow片段1、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段 活性： 5’ 3’聚合 低 5’ 3’外切 无！ 3’ 5’外切 低 2. Klenow片段的应用 末端补平 末端标记及随机引物标记 cDNA第二链合成（见cDNA文库构建）