植物细胞骨架光学显微镜观察..doc

植物细胞骨架的光学显微镜观察 黄斌 谢卓文 徐安乐 钟建良 邹天生 (中山大学生命科学学院00级生物科学专业，广州510275) ? 【摘 要】本实验根据细胞骨架的特性，利用适当浓度的TritonX-100处理洋葱鳞茎内表皮细胞，破坏细胞内大多数蛋白质而保存细胞骨架系统，再经考马斯蓝染色，在光学显微镜下观察细胞骨架，对细胞骨架的分布，膜骨架，核骨架，胞间连丝等进行了初步的研究。 【关键词】细胞骨架,光学显微镜,纤维,网络结构 ? 1 引言 细胞骨架是真核生物细胞中的重要结构，起细胞支架的作用，并参与胞内物质运输、细胞运动、分泌吸收、细胞通讯、有丝分裂等。由于与细胞各项功能的密切关系，细胞骨架的研究已成为当今细胞生物学中较具吸引力的领域之一。对细胞骨架的研究须先对其进行观察。本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料对细胞骨架进行观察研究，基本原理是细胞内脂质和大部分蛋白质可与去垢剂Triton-100形成去垢剂-蛋白/脂质复合物，从而溶于水中被提取，而结合成纤维状的细胞骨架蛋白则保持其在生活细胞中存在的状态。之后用考马斯亮蓝对蛋白质染色，使骨架系统在光学显微镜下可见，从而对其进行观察研究。 2 材料与方法 2.1 材料 新鲜洋葱鳞茎，撕取内表皮，切成约0.5cm×0.5cm大小。 2.2 器材 光学显微镜、精确天平、0.02ml移液枪、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子。 2.3 试剂： M-缓冲液：50mmol/L咪唑、50mmol/LKCl、0.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/LEDTA、1mmol/LEGTA[乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸]、1mmol/L巯基乙醇。 6mmol/LPH6.8磷酸缓冲液：0.2149g Na2HPO4·12H2O、0.0816g KH2PO4 加入100ml 蒸馏水。 1％TritonX-100：0.5ml 100％TritonX-100加入A液49.5ml。 0.2％考马斯亮蓝R250：0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。 3％戊二醛：6ml 25％戊二醛加入B液44ml。 2.4 方法 将材料置于装有PH6.8磷酸缓冲液的烧杯中，使其下沉。吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX-100处理30分钟。吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次10分钟。0.2％考马斯亮蓝R250染色30分钟。用蒸馏水洗1-2次，展平置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。选取骨架形态清晰、典型的细胞或细胞群，在适当放大倍数下摄像。 ? 3 结果与分析 3.1 细胞骨架观察结果 光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图1），细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致，但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。 3.2 细胞骨架的分布 制片可观察到较清晰的骨架结构，但是不同切片的细胞骨架在密集度、分布上有差异，可能是处于不同生理状态或处理时间不同所致。对于同一切片，边缘部分的细胞骨架较稀疏，说明Triton-100对细胞骨架蛋白有破坏作用，也反映了细胞骨架蛋白间的结合是可逆的。 3.3 核骨架 多数切片上的细胞可见蓝色较浓重的核区（图1a），但在用Triton处理较久的切片上没有核区轮廓，表明核骨架在形态分布上与细胞质骨架并无明显（至少在光镜下）差异，但由于胞核有核纤层支撑的核膜，较难被去垢剂破坏，使去垢剂难以进入核中起作用，故需处理较长时间才能得到与胞质同样的效果。 ? 图1洋葱鳞茎内表皮细胞骨架显微镜照片 a：10×10倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（箭头示细胞核区域重染色区） b：10×40倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（上方箭头示膜骨架，下方箭头示胞间连丝处骨架纤维） c：10×100倍光镜下病变细胞骨架与正常细胞的对比（注意两箭头处染色对比） ? 3.4 膜骨架 对于去垢剂的提取作用，细胞质膜首当其冲，膜脂，膜蛋白必然很快溶解，但在显微镜下可见到紧贴细胞壁的包绕细胞质的一层结构（图1b），表明细胞除胞壁维持形态外，还有膜骨架（或膜内侧细胞骨架）起作用。而且膜骨架并非孤立起作用