微波辅佐提取-高效液相色谱法测定果蔬中的Vc含量..docx

微波辅佐提取-高效液相色谱法测定果蔬中的含量应用化学 陈智毅 张天祥 潘大卫 廖年华 杨樱芝 黄秋香 黄嘉欢潘潞怡黎淑貞 谢宇虹摘要 Vc在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。本实验通过测定果蔬中的Vc含量，掌握高效液相色谱法原理及应用，熟悉一般样品前处理方法，掌握校准曲线定量法。本实验采用Phenomenex18柱(250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)；：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4水溶液（v/v）作为流动相，流速1 mL/min的HPLC操作条件；使用微波辅助提取技术提取水果中的Vc，采用紫外检测器，在265nm波长下测定Vc的吸光值。并与标准系列比较，以保留时间定性，以峰面积定量。Vc浓度在5~100mg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系（Y=38395x + 11668, R2=0.999）。关键词 微波辅佐提取 高效液相色谱法 Vc 紫外检测器引言维生素（Vitamin ，V）又叫L-抗坏血酸（Asorbi Aid），是一种水溶性维生素。研究发现，维生素C在人体内作为辅酶的成分调节机体代谢，减弱毛细血管脆性，增加机体抵抗力；维生素C的协同作用可以提高人体对铁的吸收率，促进外伤愈合。由于Vc是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效Vc的缺乏可导致多种疾病，其含量高低常作为某些疾病诊断及营养分析的重要指标，因此Vc的定量分析在食品、医药等领域相当重要【1】。下图是Vc的结构式：图1.维生素c分子结构式Vc在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中Vc含量在50-300 mg/100 g。微波辅助萃取具有快速高效、操作简便、节省溶剂等优点，在天然产物、环境、食品等领域中得到广泛应用。目前测定Vc的方法很多，包括药典中的标准方法——碘量法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、近红外分光光度法、伏安法等【2】。各种方法均有自己的独特之处，有些方法要求的实验条件和操作技术较高，而有些方法步骤烦琐，不利于快速分析。微波辅助萃取具有快速高效、操作简便、节省溶剂等优点，在天然产物、环境、食品等领域中得到广泛应用。本实验采用微波辅助萃取法快速萃取蔬果中的Vc，采用高效液相色谱进行分析，以Vc标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中Vc的峰面积，由校准曲线计算其浓度。实验部分仪器试剂仪器：高效液相色谱仪：L-2010（岛津香港有限公司）；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或Phenomenex18柱(250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)。试剂：乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；西红柿、橘子、小西红柿为果蔬样品。实验用水为超纯水。Vc标准溶液：快速准确称取0.025 g ，用1 mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1 mol/L乙酸溶液定容，得到100 mg/L标准溶液备用，现用现配。色谱条件：流动相：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4水溶液（v/v）；流速1 mL/min；紫外检测波长265 nm；进样量10 μL。实验步骤按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。（2）样品准备：准确称取切碎的蔬果样品小西红柿5.0006g，西红柿5.0220g，橘子5.0024g，以1 mol/L乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为600 W，萃取时间为10 min，萃取温度设定为恒温50℃。萃取液过滤后用1 mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供试品溶液。（3）定性分析：分别取10 μL 50 mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。（4）校准曲线绘制：分别配制5，20，50，80，100 mg/L的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析。以Vc色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。（5）定量分析：供试品溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。记录其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc的含量，结果以mg/100 g表示。（6）实验结束后，按要求清理好仪器。3.实验结果与讨论1.标准曲线的测绘表1.标准曲线的浓度和峰面积标准溶液/mg·L面积A193244758501195789831507573788688图2.标准曲线由图可得，所得标准曲线方程为：峰面积A=38395x + 11668，相关系数R2=0.999。2.各种样品提取液色谱图的绘制分别以桔子、枣子、柚子、百香果四水果的提取液为样品，色谱条件为：流动相：3%的乙腈