微生物大小的测定及显微镜直接计数法..doc

微生物学实验报告 姓名年级班组别同组者 一、目的要求 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。 了解血球计数板的构造、明确其计数原理。 学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。 基本原理 l． 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物细胞的长度. =（两重合线间镜台测微尺格数x10）/两重合线间目镜测微尺格数 2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示 图一：测微尺的校正 3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则： 1mL菌液中的总菌数= ×25×104×B=5×104×A·B （25个中格） = ×16×104×B=3.2×104×A·B（16个中格） 三、实验器材 菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis) 0.1%吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水。 3、仪器及其他用品 目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸；血细胞计 数板、移液管，小玻璃珠，烧杯，锥形瓶等 四、操作步骤 微生物大小的测定。 （1）目镜测微尺的安装 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。 （2）校正目镜测微尺 将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（图一）。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。 由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。 目镜测微尺每格长度（μm）= 菌体大小的测定 洗片→干燥→加热、固定、干燥→结晶紫染色2min→自然干燥 制作酵母水浸片 玻片中央滴一滴美蓝→接种酵母菌→盖盖玻片 将镜台测微尺取下，换上细菌制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。 同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。 显微镜计数。 对酵母菌液进行适当的梯度稀释。取原液1mL到试管中，用移液管移取9mL水注入试管中。再取上一次稀释的菌液中的1mL加到另一支试管中，加9mL水。依此类推。即可得到一系列稀释梯度的菌液。 加样品。血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出多余的菌悬液。加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。 将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所 在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀