微生物学检验基本技术..doc

1．葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F或Hugh－Leifson，HL） 下层：蛋白胨????1克????????????氯化钠????0．5克???????? 葡萄糖????0.2克????????? 水???????100毫升Bromo cresol purple)乙醇溶液0.1-0.2mL PH=7.6 注意: 调完pH值后再加葡萄糖. (1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。 (2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置3℃孵箱孵育48h以上。 (3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为产碱型；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。 (4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。 2.氧化酶试验 (1)原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。 (2)方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。 (3)结果：阳性者立即变粉红色，5-10s内呈深紫色。无色为阴性。 (4)应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于气单胞菌和假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，气单胞菌和假单胞菌属为阳性，而肠杆菌科细菌阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。 注意事项：?①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。．克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验双糖铁培养基 成份：????下层：蛋白胨????1克????????????氯化钠??????0．5克?????????????葡萄糖????0．2克?????????琼脂???????0．3-0．5克??????????水???????100毫升???????将上述物质混匀调PH7．6后加1．2%酚红0．4毫升????上层：蛋白胨?????1克?????????氯化钠??????0．5克??????????乳糖???????1克?????????硫代硫酸钠???0．03克??????????硫酸亚铁??0．02克??????琼脂?????????1克??????????水???????100毫升制法：1将下层配好，分装中号试管（1毫升），塞好包扎，15磅高压灭菌半小时，使凝固后备用。 ??????2 制上层时，先将蛋白胨水制好，加入硫酸亚铁，硫代硫酸钠，加热溶解PH8．1，再加入酚红分瓶，（每瓶300毫升，称取琼脂包扎灭菌，趁热加入乳糖隔水煮沸30分钟或112℃消毒15分钟）。??????3 取已制的下层管，每管用无菌法倒入上层液约1。5毫升，边斜放置使成斜面，凝固后备用。标准：无菌试验合格，接种大肠杆菌下层产酸产气，上层产酸。试验(1)原理：克氏双糖铁(KIA)或三糖铁琼脂(TSI)培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。?(2)方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA或TSI深层，距管底3~5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵?育18~24h，观察结果。(3)结果：常见的KIA反应有如下几种：?①斜面碱性/底层碱性：不发酵碳水化合物，系不发酵菌的特征