微生物实验思考题(南京工业大学生物与制药工程学院)..doc

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微生物实验思考题(南京工业大学生物与制药工程学院).

实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察 实验原理 简单染色采用一种染料对菌体进行染色,常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。染色后,菌体与背景形成鲜明对比,在显微镜下很容易被识别。通过简单染色方法可以观察细菌的菌体形态特征和菌体的排列方式。 观察菌体形态 简单染色 (只用一种染料) 观察菌体排列方式 染色方法 革兰氏染色 鉴别 鉴别染色 抗酸性染色 (利用两种染料) 芽孢染色 观察特殊结构 荚膜染色 鞭毛染色 二、实验步骤: 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检 三、思考题 制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节? 答;(1)涂片:开始所加无菌水液滴不要太大,否则不易干燥; 取菌量要适宜且要涂抹均匀,避免过大造成堆积,而难以看清细胞个体形态 同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。 (2)无菌操作取菌:一定要等接种换冷却后再取菌,以免高温使菌体变形; (3)干燥固定:干燥后加热固定,可避免加热时间过长,否则细胞会破裂或变形; (4)固定:菌膜一面朝上,通过酒精灯微火三次。注意温度不宜过高,时间不宜太长,否则菌体形态则会发生改变。 (5)水洗:倾去染色液后,用水沿着菌膜四周冲洗,注意勿使水流直接冲洗菌膜部位,水流不宜过急,过大,至流出水无色为止; 为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察? 答:使用油镜时,物镜与标本间的介质为香柏油(N=1.515),不仅增加了透明度,而且会提高了分辨率。 若制片不完全干燥后,就用油镜观察,则N会减小,分辨率D也会变小。而且还会造成油水两相不互溶,所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。 如果涂片未经加热固定,将会出现什么问题?如果加热温度过高,时间太长,又会怎样呢? 答:加热固定的作用是使细胞质凝固,使细胞固定在载玻片上,这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态,而且还可增加细胞对染料亲和力。 (1)如果图涂片未经加热固定,则细胞无法固定在载玻片上,在染色水洗后会被水流冲走。 (2)如果加热温度过高,时间太长,则会使细菌形态发生变化甚至破裂。 为什么细菌染色常用碱性染料?什么情况下用酸性染料? 答:(1)细菌染色常用碱性染料,原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷,而碱性染料电离后染色部分带正电荷,很容易与细胞结合使其着色。 (2)当细胞处于酸性条件下(如细菌分解糖类产酸)所带正电荷增加时,可采用酸性染料染色。 实验二 细菌的革兰氏染色法 实验原理 革兰氏染色是细菌染色中重要的鉴别染色方法之一。通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)。 G+和G-主要是由于细胞壁结构和化学成分的差异引起脱色能力的不同。 ①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的化合物。 ②乙醇脱色: 细胞壁较厚 结晶紫与碘液复合物留在细 G+ 胞壁内,使其保持紫色。 肽聚网层次多和交联致密且不含类脂 细胞壁较薄 结晶紫与碘复合物溶出,细 G- 胞壁退成无色 肽聚网层薄和交联差,外膜层类脂含量高 ③番红染色:G-细菌呈现红色,而G+细菌则仍保留最初的紫色。 实验步骤 立即水洗

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